Calculadora de Ligación de ADN - Calcular Proporciones de Inserto:Vector para Clonación Molecular

La ligación del ADN es el paso de la clonación molecular en el que un fragmento inserto se une a un vector plasmídico mediante la enzima ADN ligasa T4. Una calculadora de ligación de ADN determina cuántos microlitros de ADN inserto y de ADN vector se deben mezclar para que la reacción alcance una proporción molar elegida de inserto respecto del vector.

Qué hace la calculadora

La calculadora recibe seis datos: concentración del vector, longitud del vector, concentración del inserto, longitud del inserto, proporción molar objetivo de inserto respecto del vector y volumen total de la reacción. También permite establecer cuánto ADN vector se utilizará; el valor predeterminado es 50 nanogramos (ng). A partir de estos valores, calcula el volumen de vector que se debe pipetear, el volumen de inserto que se debe pipetear y cuánto tampón o agua se debe añadir para alcanzar el volumen total de la reacción.

La concentración se mide en nanogramos por microlitro (ng/μL), normalmente con un instrumento Nanodrop o Qubit. La longitud se mide en pares de bases (pb). Un kilobase (kb) equivale a 1000 pares de bases. La proporción molar indica cuántas moléculas de inserto deben estar presentes por cada molécula de vector. No es una proporción de masas.

Por qué se utiliza la proporción molar y no la masa

Masas iguales de ADN no contienen el mismo número de moléculas. Un inserto corto pesa menos que un vector largo con el mismo número de moléculas. Mezclar cantidades iguales en nanogramos de un inserto corto y un vector largo dejaría muy pocas moléculas de inserto en relación con las moléculas de vector. La calculadora escala la masa del inserto según la proporción entre las longitudes de los fragmentos, de modo que la mezcla final tenga el número previsto de moléculas de inserto por cada molécula de vector.

Fórmula de la ligación del ADN

La cantidad necesaria de ADN inserto, en nanogramos, es:

$m_i = m_v \times \frac{k_i}{k_v} \times R$

donde $m_i$ es la cantidad de inserto en nanogramos, $m_v$ la cantidad de vector en nanogramos, $k_i$ la longitud del inserto en kilobases, $k_v$ la longitud del vector en kilobases y R la proporción molar objetivo de inserto a vector.

Una vez conocida esa cantidad, la calculadora convierte cada cantidad en un volumen que se puede pipetear:

$V_v = \frac{m_v}{c_v}$

$V_i = \frac{m_i}{c_i}$

$V_b = V_t - V_v - V_i$

donde $V_v$ y $V_i$ son los volúmenes del vector y del inserto en microlitros, $c_v$ y $c_i$ son las concentraciones del vector y del inserto en nanogramos por microlitro, $V_b$ es el volumen del tampón y $V_t$ el volumen total de la reacción.

Si los volúmenes del vector y del inserto juntos superan el volumen total de la reacción, no queda espacio para el tampón, la ligasa ni el agua. En ese caso, la calculadora indica que el volumen total es demasiado pequeño en lugar de mostrar una cantidad negativa de tampón.

Ejemplo resuelto

Un investigador está clonando un fragmento génico de 1 kb en un vector plasmídico de 3 kb. El plan es utilizar 50 ng de ADN vector con una proporción molar inserto:vector de 3:1, en una reacción de 20 μL.

Datos de entrada:

• Concentración del vector: 50 ng/μL
• Longitud del vector: 3000 pb (3 kb)
• Concentración del inserto: 25 ng/μL
• Longitud del inserto: 1000 pb (1 kb)
• Proporción molar: 3
• Volumen total: 20 μL
• Cantidad de vector: 50 ng

Paso 1: cantidad de inserto

ng de inserto = 50 × (1 ÷ 3) × 3 = 50 ng

Paso 2: volúmenes

Volumen de vector = 50 ng ÷ 50 ng/μL = 1 μL

Volumen de inserto = 50 ng ÷ 25 ng/μL = 2 μL

Volumen de tampón = 20 − 1 − 2 = 17 μL

La reacción contiene 1 μL de vector, 2 μL de inserto y 17 μL de tampón o agua, que es también donde se añaden la ligasa y su tampón de reacción. Esta mezcla proporciona tres moléculas de inserto por cada molécula de vector.

Proporciones molares habituales para la ligación

La mayoría de las clonaciones estándar con extremos cohesivos salientes utiliza una proporción inserto:vector de 3:1. Las ligaciones que unen extremos romos son menos eficientes, por lo que es habitual utilizar una proporción mayor, como 5:1. En ocasiones, los insertos muy grandes funcionan mejor con una proporción menor, cercana a 1:1, ya que los fragmentos grandes ya aportan muchos pares de bases por molécula.

Preguntas frecuentes

¿Qué es la ligación del ADN?

La ligación del ADN es la unión de dos fragmentos de ADN, normalmente un vector plasmídico y un inserto, para formar una sola molécula continua. La enzima ADN ligasa T4 sella la unión entre los extremos de los fragmentos.

¿Qué significa la proporción molar inserto:vector?

Es el número de moléculas de ADN inserto presentes por cada molécula de vector en la reacción. Una proporción de 3:1 significa tres moléculas de inserto por cada molécula de vector, independientemente de cómo se comparen sus masas.

¿Por qué no se utilizan cantidades iguales en nanogramos de vector e inserto?

Los fragmentos de ADN de distintas longitudes tienen masas diferentes por molécula. Un inserto de 1 kb pesa aproximadamente un tercio de lo que pesa un vector de 3 kb, molécula por molécula. Utilizar cantidades iguales en nanogramos de cada uno no produciría el mismo número de moléculas, por lo que la calculadora ajusta la masa del inserto para alcanzar la proporción molar objetivo.

¿Qué significa que el volumen total sea demasiado pequeño?

Significa que los volúmenes del vector y del inserto por sí solos ya ocupan todo el volumen de la reacción, sin dejar espacio para el tampón o la ligasa. La solución es aumentar el volumen total de la reacción o utilizar soluciones de ADN más concentradas.

¿Se puede utilizar esta calculadora para el ensamblaje de Gibson o la clonación Golden Gate?

No. Esos métodos utilizan una química de reacción diferente y normalmente buscan cantidades equimolares de todos los fragmentos, en lugar de una proporción fija de inserto respecto del vector. Sus cálculos de volumen difieren de los de la clonación estándar con ligasa T4.

¿Cuánto ADN vector se utiliza habitualmente?

50 ng es una cantidad inicial habitual para una reacción de ligación estándar. Los laboratorios también utilizan cantidades de 25 a 100 ng, ajustadas según la concentración del ADN y la escala de la reacción.