Calculadora de Ligation de ADN

Introducción

La ligación de ADN es una técnica crítica de biología molecular utilizada para unir fragmentos de ADN mediante enlaces covalentes. La Calculadora de Ligation de ADN es una herramienta esencial para los investigadores, ayudando a determinar las cantidades óptimas de ADN vectorial e insertado necesarias para reacciones de ligación exitosas. Al calcular las proporciones molares correctas entre el vector (plásmido) y los fragmentos de ADN insertados, esta calculadora asegura experimentos de clonación molecular eficientes mientras minimiza los reactivos desperdiciados y las reacciones fallidas.

Las reacciones de ligación son fundamentales para la ingeniería genética, la biología sintética y los procedimientos de clonación molecular. Permiten a los científicos crear moléculas de ADN recombinante al insertar genes de interés en vectores de plásmido para su posterior transformación en organismos hospedadores. El éxito de estas reacciones depende en gran medida del uso de las cantidades apropiadas de componentes de ADN, que es precisamente lo que esta calculadora ayuda a determinar.

Ya sea que esté construyendo vectores de expresión, creando bibliotecas de genes o realizando subclonaciones de rutina, esta calculadora de ligación de ADN lo ayudará a optimizar sus condiciones experimentales y aumentar su tasa de éxito. Al ingresar algunos parámetros clave sobre sus muestras de ADN, puede obtener rápidamente los volúmenes exactos necesarios para su reacción de ligación específica.

Fórmula/Cálculo

La calculadora de ligación de ADN utiliza una fórmula fundamental de biología molecular que tiene en cuenta los diferentes tamaños y concentraciones de los fragmentos de ADN que se están uniendo. El cálculo principal determina cuánta cantidad de ADN insertado se necesita en relación con el ADN vectorial en función de sus respectivas longitudes y la relación molar deseada.

Cálculo de la Cantidad de Insertos

La cantidad de ADN insertado necesaria (en nanogramos) se calcula utilizando la siguiente fórmula:

$\text{ng de inserto} = \text{ng de vector} \times \frac{\text{tamaño de inserto en kb}}{\text{tamaño de vector en kb}} \times \text{relación molar}$

Donde:

• ng de vector = cantidad de ADN vectorial utilizada en la reacción (típicamente 50-100 ng)
• tamaño de inserto en kb = longitud del fragmento de ADN insertado en kilobases (kb)
• tamaño de vector en kb = longitud del ADN vectorial en kilobases (kb)
• relación molar = relación deseada de moléculas de inserto a moléculas de vector (típicamente de 3:1 a 5:1)

Cálculos de Volumen

Una vez que se determina la cantidad requerida de ADN insertado, se calculan los volúmenes necesarios para la reacción:

$\text{Volumen de vector (μL)} = \frac{\text{ng de vector}}{\text{concentración de vector (ng/μL)}}$

$\text{Volumen de inserto (μL)} = \frac{\text{ng de inserto}}{\text{concentración de inserto (ng/μL)}}$

$\text{Volumen de buffer/agua (μL)} = \text{Volumen total de reacción (μL)} - \text{Volumen de vector (μL)} - \text{Volumen de inserto (μL)}$

Ejemplo de Cálculo

Vamos a trabajar a través de un ejemplo práctico:

• Concentración de vector: 50 ng/μL
• Longitud de vector: 3000 bp (3 kb)
• Concentración de inserto: 25 ng/μL
• Longitud de inserto: 1000 bp (1 kb)
• Relación molar deseada (inserto:vector): 3:1
• Volumen total de reacción: 20 μL
• Cantidad de vector a usar: 50 ng

Paso 1: Calcular la cantidad de inserto requerida $\text{ng de inserto} = 50 \text{ ng} \times \frac{1 \text{ kb}}{3 \text{ kb}} \times 3 = 50 \times 0.33 \times 3 = 50 \text{ ng}$

Paso 2: Calcular los volúmenes $\text{Volumen de vector} = \frac{50 \text{ ng}}{50 \text{ ng/μL}} = 1 \text{ μL}$

$\text{Volumen de inserto} = \frac{50 \text{ ng}}{25 \text{ ng/μL}} = 2 \text{ μL}$

$\text{Volumen de buffer/agua} = 20 \text{ μL} - 1 \text{ μL} - 2 \text{ μL} = 17 \text{ μL}$

Este cálculo asegura que haya tres moléculas de inserto por cada molécula de vector en la reacción, optimizando las posibilidades de ligación exitosa.

Guía Paso a Paso para Usar la Calculadora

Nuestra calculadora de ligación de ADN está diseñada para ser intuitiva y sencilla. Siga estos pasos para calcular los volúmenes óptimos para su reacción de ligación:

1. Ingrese Información del Vector:

   • Ingrese la concentración de su vector en ng/μL
   • Ingrese la longitud del vector en pares de bases (bp)
   • Especifique la cantidad de ADN vectorial que desea usar en la reacción (ng)

2. Ingrese Información del Inserto:

   • Ingrese la concentración de su inserto en ng/μL
   • Ingrese la longitud del inserto en pares de bases (bp)

3. Establezca Parámetros de Reacción:

   • Especifique la relación molar deseada (inserto:vector) - típicamente entre 3:1 y 5:1
   • Ingrese el volumen total de reacción en μL (generalmente 10-20 μL)

4. Vea Resultados:

   • La calculadora mostrará automáticamente:
     • Volumen de vector requerido (μL)
     • Volumen de inserto requerido (μL)
     • Volumen de buffer/agua a agregar (μL)
     • Volumen total de reacción (μL)
     • Cantidad de ADN vectorial e insertado en la reacción (ng)

5. Copiar Resultados (opcional):

   • Utilice el botón "Copiar Resultados" para copiar todos los cálculos en su portapapeles para su cuaderno de laboratorio o protocolos

La calculadora realiza verificaciones de validación para asegurar que todas las entradas sean números positivos y que el volumen total sea suficiente para los volúmenes de ADN requeridos. Si se detectan errores, mensajes de error útiles le guiarán para corregir las entradas.

Casos de Uso

La calculadora de ligación de ADN es valiosa en numerosas aplicaciones de biología molecular:

Clonación Molecular

El caso de uso más común es la clonación molecular estándar, donde los investigadores insertan genes o fragmentos de ADN en vectores de plásmido. La calculadora asegura condiciones óptimas para:

• Subclonación de genes entre diferentes vectores de expresión
• Creación de proteínas de fusión uniendo múltiples fragmentos de genes
• Construcción de ensayos de genes reporteros
• Construcción de bibliotecas de plásmidos

Biología Sintética

En biología sintética, donde a menudo se ensamblan múltiples fragmentos de ADN:

• Las reacciones de Gibson Assembly se benefician de proporciones precisas de inserto:vector
• Los sistemas de ensamblaje Golden Gate requieren concentraciones específicas de ADN
• Ensamblaje de BioBrick de partes genéticas estandarizadas
• Construcción de circuitos genéticos sintéticos

Desarrollo de Kits de Diagnóstico

Al desarrollar herramientas de diagnóstico molecular:

• Clonación de marcadores genéticos específicos de enfermedades
• Construcción de plásmidos de control positivo
• Desarrollo de estándares de calibración para qPCR

Sistemas de Expresión de Proteínas

Para investigadores que trabajan en la producción de proteínas:

• Optimización de relaciones inserto:vector para vectores de expresión de alta copia
• Construcción de sistemas de expresión inducibles
• Creación de vectores de secreción para purificación de proteínas

Aplicaciones de CRISPR-Cas9

En aplicaciones de edición del genoma:

• Clonación de ARN guías en vectores CRISPR
• Creación de plantillas donadoras para reparación dirigida por homología
• Construcción de bibliotecas de ARN guías para cribado

Ligaciones Desafiantes

La calculadora es particularmente valiosa para escenarios de ligación desafiantes:

• Clonación de inserciones grandes (>5 kb)
• Inserciones de fragmentos muy pequeños (<100 bp)
• Ligaciones de extremos romos que tienen menor eficiencia
• Reacciones de ensamblaje de múltiples fragmentos

Alternativas

Si bien nuestra calculadora de ligación de ADN proporciona cálculos precisos para reacciones de ligación tradicionales, existen varios enfoques alternativos para unir fragmentos de ADN:

1. Gibson Assembly: Utiliza exonucleasa, polimerasa y ligasa en una reacción de tubo único para unir fragmentos de ADN superpuestos. No se necesita un cálculo de ligación tradicional, pero las relaciones de concentración siguen siendo importantes.

2. Golden Gate Assembly: Utiliza enzimas de restricción tipo IIS para ensamblaje direccional y sin cicatrices de múltiples fragmentos. Requiere cantidades equimolares de todos los fragmentos.

3. SLIC (Clonación Independiente de Secuencia y Ligación): Utiliza exonucleasa para crear sobrehangs de cadena sencilla que se unen entre sí. Normalmente utiliza relaciones equimolares de fragmentos.

4. In-Fusion Cloning: Sistema comercial que permite unir fragmentos con superposiciones de 15 pb. Utiliza una relación específica basada en los tamaños de los fragmentos.

5. Gateway Cloning: Utiliza recombinación específica del sitio en lugar de ligación. Requiere vectores de entrada y destino específicos.

6. Pruebas Empíricas: Algunos laboratorios prefieren establecer múltiples reacciones de ligación con diferentes relaciones inserto:vector (1:1, 3:1, 5:1, 10:1) y determinar cuál funciona mejor para sus construcciones específicas.

7. Calculadoras de Software: Paquetes de software comerciales como Vector NTI y SnapGene incluyen calculadoras de ligación con características adicionales como análisis de sitios de restricción.

Historia

El desarrollo de cálculos de ligación de ADN paralela la evolución de técnicas de clonación molecular, que han revolucionado la biología molecular y la biotecnología.

Primeros Desarrollos (1970s)

El concepto de ligación de ADN para clonación molecular surgió a principios de la década de 1970 con el trabajo pionero de Paul Berg, Herbert Boyer y Stanley Cohen, quienes desarrollaron las primeras moléculas de ADN recombinante. Durante este período, las reacciones de ligación eran en gran medida empíricas, con investigadores utilizando prueba y error para determinar las condiciones óptimas.

El descubrimiento de las enzimas de restricción y la ligasa de ADN proporcionó las herramientas esenciales para cortar y volver a unir moléculas de ADN. La ligasa de ADN T4, aislada de E. coli infectada por el bacteriófago T4, se convirtió en la enzima estándar para unir fragmentos de ADN debido a su capacidad para ligar tanto extremos romos como cohesivos.

Período de Refinamiento (1980s-1990s)

A medida que la clonación molecular se volvía más rutinaria, los investigadores comenzaron a desarrollar enfoques más sistemáticos para las reacciones de ligación. La importancia de las relaciones molares entre el ADN vectorial e insertado se hizo evidente, lo que llevó al desarrollo de la fórmula básica que aún se utiliza hoy.

Durante este período, los investigadores establecieron que el exceso de ADN insertado (típicamente de 3:1 a 5:1 de relación molar de inserto a vector) generalmente mejoraba la eficiencia de ligación para aplicaciones de clonación estándar. Este conocimiento se compartió inicialmente a través de protocolos de laboratorio y gradualmente llegó a manuales y libros de texto de biología molecular.

Era Moderna (2000s-Presente)

La llegada de herramientas computacionales y calculadoras en línea en la década de 2000 hizo que los cálculos precisos de ligación fueran más accesibles para los investigadores. A medida que las técnicas de biología molecular se volvían más sofisticadas, la necesidad de cálculos precisos se volvía más crítica, especialmente para proyectos de clonación desafiantes que involucraban múltiples fragmentos o inserciones grandes.

Hoy en día, los cálculos de ligación de ADN son una parte integral de los flujos de trabajo de clonación molecular, con calculadoras dedicadas como esta ayudando a los investigadores a optimizar sus experimentos. La fórmula básica ha permanecido en gran medida sin cambios, aunque nuestra comprensión de los factores que afectan la eficiencia de ligación ha mejorado.

La aparición de métodos de clonación alternativos como Gibson Assembly y Golden Gate cloning ha introducido nuevas necesidades de cálculo, pero el concepto fundamental de relaciones molares entre fragmentos de ADN sigue siendo importante en estas técnicas.

Ejemplos de Código

Aquí hay implementaciones de la calculadora de ligación de ADN en varios lenguajes de programación:

1' Función VBA de Excel para la Calculadora de Ligation de ADN
2Function CalculateInsertAmount(vectorAmount As Double, vectorLength As Double, insertLength As Double, molarRatio As Double) As Double
3    ' Calcular la cantidad de inserto requerida en ng
4    CalculateInsertAmount = vectorAmount * (insertLength / vectorLength) * molarRatio
5End Function
6
7Function CalculateVectorVolume(vectorAmount As Double, vectorConcentration As Double) As Double
8    ' Calcular el volumen de vector en μL
9    CalculateVectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration
10End Function
11
12Function CalculateInsertVolume(insertAmount As Double, insertConcentration As Double) As Double
13    ' Calcular el volumen de inserto en μL
14    CalculateInsertVolume = insertAmount / insertConcentration
15End Function
16
17Function CalculateBufferVolume(totalVolume As Double, vectorVolume As Double, insertVolume As Double) As Double
18    ' Calcular el volumen de buffer/agua en μL
19    CalculateBufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume
20End Function
21
22' Ejemplo de uso en una celda:
23' =CalculateInsertAmount(50, 3000, 1000, 3)
24

1def calculate_ligation_volumes(vector_concentration, vector_length, insert_concentration, 
2                              insert_length, molar_ratio, total_volume, vector_amount=50):
3    """
4    Calcular volúmenes para una reacción de ligación de ADN.
5    
6    Parámetros:
7    vector_concentration (float): Concentración de ADN vectorial en ng/μL
8    vector_length (float): Longitud del ADN vectorial en pares de bases
9    insert_concentration (float): Concentración de ADN insertado en ng/μL
10    insert_length (float): Longitud del ADN insertado en pares de bases
11    molar_ratio (float): Relación molar deseada de inserto:vector
12    total_volume (float): Volumen total de reacción en μL
13    vector_amount (float): Cantidad de ADN vectorial a usar en ng (predeterminado: 50)
14    
15    Devuelve:
16    dict: Diccionario que contiene volúmenes y cantidades calculadas
17    """
18    # Calcular volumen de vector
19    vector_volume = vector_amount / vector_concentration
20    
21    # Calcular cantidad de inserto requerida
22    vector_length_kb = vector_length / 1000
23    insert_length_kb = insert_length / 1000
24    insert_amount = (vector_amount * insert_length_kb / vector_length_kb) * molar_ratio
25    
26    # Calcular volumen de inserto
27    insert_volume = insert_amount / insert_concentration
28    
29    # Calcular volumen de buffer/agua
30    buffer_volume = total_volume - vector_volume - insert_volume
31    
32    return {
33        "vector_volume": round(vector_volume, 2),
34        "insert_volume": round(insert_volume, 2),
35        "buffer_volume": round(buffer_volume, 2),
36        "insert_amount": round(insert_amount, 2),
37        "vector_amount": vector_amount
38    }
39
40# Ejemplo de uso
41result = calculate_ligation_volumes(
42    vector_concentration=50,
43    vector_length=3000,
44    insert_concentration=25,
45    insert_length=1000,
46    molar_ratio=3,
47    total_volume=20
48)
49
50print(f"Vector: {result['vector_volume']} μL ({result['vector_amount']} ng)")
51print(f"Inserto: {result['insert_volume']} μL ({result['insert_amount']} ng)")
52print(f"Buffer: {result['buffer_volume']} μL")
53print(f"Total: 20 μL")
54

1function calculateLigationVolumes(vectorConcentration, vectorLength, insertConcentration, 
2                                insertLength, molarRatio, totalVolume, vectorAmount = 50) {
3  // Convertir longitudes a kb para el cálculo
4  const vectorLengthKb = vectorLength / 1000;
5  const insertLengthKb = insertLength / 1000;
6  
7  // Calcular cantidad de inserto requerida
8  const insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
9  
10  // Calcular volúmenes
11  const vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
12  const insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
13  const bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
14  
15  return {
16    vectorVolume: parseFloat(vectorVolume.toFixed(2)),
17    insertVolume: parseFloat(insertVolume.toFixed(2)),
18    bufferVolume: parseFloat(bufferVolume.toFixed(2)),
19    insertAmount: parseFloat(insertAmount.toFixed(2)),
20    vectorAmount: vectorAmount
21  };
22}
23
24// Ejemplo de uso
25const result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
26console.log(`Vector: ${result.vectorVolume} μL (${result.vectorAmount} ng)`);
27console.log(`Inserto: ${result.insertVolume} μL (${result.insertAmount} ng)`);
28console.log(`Buffer: ${result.bufferVolume} μL`);
29console.log(`Total: 20 μL`);
30

1public class DNALigationCalculator {
2    public static class LigationResult {
3        public final double vectorVolume;
4        public final double insertVolume;
5        public final double bufferVolume;
6        public final double insertAmount;
7        public final double vectorAmount;
8        
9        public LigationResult(double vectorVolume, double insertVolume, double bufferVolume, 
10                             double insertAmount, double vectorAmount) {
11            this.vectorVolume = vectorVolume;
12            this.insertVolume = insertVolume;
13            this.bufferVolume = bufferVolume;
14            this.insertAmount = insertAmount;
15            this.vectorAmount = vectorAmount;
16        }
17    }
18    
19    public static LigationResult calculateLigationVolumes(
20            double vectorConcentration, double vectorLength, 
21            double insertConcentration, double insertLength,
22            double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount) {
23        
24        // Convertir longitudes a kb
25        double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
26        double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
27        
28        // Calcular cantidad de inserto requerida
29        double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
30        
31        // Calcular volúmenes
32        double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
33        double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
34        double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
35        
36        // Redondear a 2 decimales
37        vectorVolume = Math.round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
38        insertVolume = Math.round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
39        bufferVolume = Math.round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
40        insertAmount = Math.round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
41        
42        return new LigationResult(vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount);
43    }
44    
45    public static void main(String[] args) {
46        LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20, 50);
47        
48        System.out.printf("Vector: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.vectorVolume, result.vectorAmount);
49        System.out.printf("Inserto: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.insertVolume, result.insertAmount);
50        System.out.printf("Buffer: %.2f μL%n", result.bufferVolume);
51        System.out.printf("Total: 20 μL%n");
52    }
53}
54

1#include <iostream>
2#include <cmath>
3#include <iomanip>
4
5struct LigationResult {
6    double vectorVolume;
7    double insertVolume;
8    double bufferVolume;
9    double insertAmount;
10    double vectorAmount;
11};
12
13LigationResult calculateLigationVolumes(
14    double vectorConcentration, double vectorLength,
15    double insertConcentration, double insertLength,
16    double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount = 50.0) {
17    
18    // Convertir longitudes a kb
19    double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
20    double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
21    
22    // Calcular cantidad de inserto requerida
23    double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
24    
25    // Calcular volúmenes
26    double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
27    double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
28    double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
29    
30    // Redondear a 2 decimales
31    vectorVolume = std::round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
32    insertVolume = std::round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
33    bufferVolume = std::round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
34    insertAmount = std::round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
35    
36    return {vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount};
37}
38
39int main() {
40    LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
41    
42    std::cout << std::fixed << std::setprecision(2);
43    std::cout << "Vector: " << result.vectorVolume << " μL (" << result.vectorAmount << " ng)" << std::endl;
44    std::cout << "Inserto: " << result.insertVolume << " μL (" << result.insertAmount << " ng)" << std::endl;
45    std::cout << "Buffer: " << result.bufferVolume << " μL" << std::endl;
46    std::cout << "Total: 20 μL" << std::endl;
47    
48    return 0;
49}
50

Preguntas Frecuentes (FAQ)

¿Cuál es la relación molar óptima para la ligación de ADN?

La relación molar óptima de inserto a vector típicamente varía de 3:1 a 5:1 para aplicaciones de clonación estándar. Sin embargo, esto puede variar dependiendo del escenario de ligación específico:

• Para ligaciones de extremos romos: 3:1 a 5:1
• Para ligaciones de extremos cohesivos: 1:1 a 3:1
• Para inserciones grandes (>10 kb): 1:1 a 2:1
• Para inserciones pequeñas (<500 bp): 5:1 a 10:1
• Para ensamblaje de múltiples fragmentos: 3:1 para cada inserto a vector

¿Por qué mi reacción de ligación está fallando a pesar de usar los volúmenes calculados?

Varios factores pueden afectar la eficiencia de ligación más allá de la relación molar:

1. Calidad del ADN: Asegúrese de que tanto el vector como el inserto tengan extremos limpios sin daños.
2. Defoforilación: Verifique si su vector fue defosforilado, lo que previene la auto-ligación.
3. Actividad enzimática: Verifique que su ligasa esté activa y utilizada a la temperatura correcta.
4. Tiempo de incubación: Algunas ligaciones se benefician de un tiempo de incubación más largo (durante la noche a 16°C).
5. Condiciones del buffer: Asegúrese de usar el buffer correcto con ATP.
6. Contaminantes: Purifique el ADN para eliminar inhibidores como EDTA o sal alta.

¿Cuánto ADN vectorial debo usar en una reacción de ligación?

Típicamente, se recomienda usar de 50 a 100 ng de ADN vectorial para reacciones de ligación estándar. Usar demasiado vector puede llevar a un mayor fondo de vector no cortado o auto-ligado, mientras que usar muy poco puede reducir la eficiencia de transformación. Para ligaciones desafiantes, puede que necesite optimizar esta cantidad.

¿Debo ajustar los cálculos para ligaciones de extremos romos frente a extremos cohesivos?

Sí. Las ligaciones de extremos romos son generalmente menos eficientes que las ligaciones de extremos cohesivos. Para ligaciones de extremos romos, use:

• Relaciones molares más altas (3:1 a 5:1 o incluso más).
• Más ligasa de ADN T4 (típicamente 2-3 veces más).
• Tiempos de incubación más largos.
• Considere agregar PEG para mejorar la eficiencia de ligación.

¿Cómo calculo la ligación para múltiples insertos?

Para el ensamblaje de múltiples fragmentos:

1. Calcule cada cantidad de inserto individualmente utilizando la misma fórmula.
2. Mantenga la misma relación molar total (por ejemplo, para dos insertos, use 1.5:1.5:1 inserto1:inserto2:vector).
3. Ajuste el volumen total de reacción para acomodar todos los fragmentos de ADN.
4. Considere la ligación secuencial o el uso de métodos de ensamblaje como Gibson Assembly para múltiples fragmentos.

¿Puedo usar esta calculadora para Gibson Assembly o Golden Gate Assembly?

Esta calculadora está diseñada específicamente para la clonación basada en enzimas de restricción y ligasa tradicionales. Para Gibson Assembly, generalmente se recomiendan cantidades equimolares de todos los fragmentos (relación 1:1), aunque el cálculo básico de la cantidad de ADN basado en la longitud es similar. Para Golden Gate Assembly, también se utilizan relaciones equimolares de todos los componentes.

¿Cómo tengo en cuenta la defosforilación del vector en mis cálculos?

La defosforilación del vector (eliminación de grupos fosfato 5') previene la auto-ligación, pero no cambia los cálculos de cantidad. Sin embargo, para vectores defosforilados:

1. Use ADN insertado fresco con 5' fosfatos intactos.
2. Considere usar relaciones de inserto:vector ligeramente más altas (de 4:1 a 6:1).
3. Asegúrese de tiempos de ligación más largos (al menos 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche a 16°C).

¿Cuál es el volumen mínimo total de reacción que debo usar?

El volumen mínimo práctico de reacción es típicamente de 10 μL, lo que permite una mezcla adecuada y previene problemas de evaporación. Si sus volúmenes de ADN calculados exceden el volumen de reacción deseado, tiene varias opciones:

1. Use muestras de ADN más concentradas.
2. Reduzca la cantidad de vector utilizada (por ejemplo, 25 ng en lugar de 50 ng).
3. Aumente el volumen total de reacción.
4. Considere concentrar sus muestras de ADN.

¿Cuánto tiempo debo incubar mi reacción de ligación?

Los tiempos de incubación óptimos varían según el tipo de ligación:

• Ligaciones de extremos cohesivos: 1 hora a temperatura ambiente (22-25°C) o 4-16 horas a 16°C.
• Ligaciones de extremos romos: 2-4 horas a temperatura ambiente o durante la noche (12-16 horas) a 16°C.
• Ligaciones rápidas (usando ligasa de alta concentración): 5-15 minutos a temperatura ambiente.

¿Puedo reutilizar la reacción de ligación sobrante para transformación?

Sí, las mezclas de ligación pueden almacenarse típicamente a -20°C y reutilizarse para transformación. Sin embargo, cada ciclo de congelación-descongelación puede reducir la eficiencia. Para obtener los mejores resultados:

1. Almacene la mezcla de ligación antes de congelar.
2. Inactive térmicamente la ligasa (65°C durante 10 minutos) antes del almacenamiento.
3. Úselo dentro de 1-2 meses para obtener resultados óptimos.

Referencias

1. Sambrook J, Russell DW. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3ra ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

2. Green MR, Sambrook J. (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4ta ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

3. Engler C, Kandzia R, Marillonnet S. (2008). A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS ONE, 3(11), e3647. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003647

4. Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. (2009). Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods, 6(5), 343-345. https://doi.org/10.1038/nmeth.1318

5. Aslanidis C, de Jong PJ. (1990). Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research, 18(20), 6069-6074. https://doi.org/10.1093/nar/18.20.6069

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7. Addgene - Referencia de Biología Molecular. https://www.addgene.org/mol-bio-reference/

8. New England Biolabs (NEB) - Protocolo de Ligation de ADN. https://www.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202

9. Thermo Fisher Scientific - Referencia Técnica de Clonación Molecular. https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center.html

10. Promega - Manual Técnico de Clonación. https://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/cloning/