Arvutage täpsed näidise mahud BCA katse neeldumise näitude ja soovitud valgu massi põhjal. Oluline ühtlase valgukoormuse tagamiseks western blotides ja muudes laborirakendustes.
See tööriist arvutab vajaliku näidismahu BCA neeldumise tulemuste ja näidise massi põhjal. Sisestage iga näidise neeldumise väärtus ja mass, et arvutada vastav näidismah.
Näidismaht arvutatakse järgmise valemi abil:
• tipAbsorbanceRange
• tipSampleMass
• tipSampleVolume
• tipStandardCurve
BCA Absorbance Sample Volume Calculator on spetsiaalne tööriist, mis on loodud teadlastele ja laboritehnikutele, et täpselt määrata katse jaoks sobiv proovimaht BCA (bikinchoninic acid) testi tulemuste põhjal. See kalkulaator võtab teie BCA testi neeldumise näidud ja soovitud proovimassi, et arvutada täpne maht, mis on vajalik ühtlase valgu laadimise jaoks rakendustes nagu western blotting, ensümaatilised katsed ja muud valgu analüüsi tehnikad.
BCA test on üks laialdaselt kasutatavaid meetodeid valgu kvantifitseerimiseks biokeemia ja molekulaarbioloogia laborites. Mõõtes teie valgu proovide neeldumist ja võrreldes neid standardkõveraga, saate määrata valgu kontsentratsiooni kõrge täpsusega. Meie kalkulaator lihtsustab seda protsessi, muutes neeldumise näidud automaatselt täpseteks proovimahuteks, mis on vajalikud teie katseteks.
Bikinchoninic Acid (BCA) test on biokeemiline test, mis määrab lahuses oleva valgu kogukontsentratsiooni. Selle testi põhimõte põhineb Cu²⁺-valgu kompleksi moodustumisel aluselistes tingimustes, millele järgneb Cu²⁺-i vähendamine Cu¹⁺-iks. Vähendamise hulk on proportsionaalne kohaloleva valguga. BCA moodustab aluselistes keskkondades Cu¹⁺-iga lilla värvi kompleksi, mis annab aluse jälgida vase vähendamist valkude poolt.
Lilla värvi intensiivsus suureneb proportsionaalselt valgu kontsentratsiooniga, mida saab mõõta spektrofotomeetriga umbes 562 nm juures. Neeldumise näidud võrreldakse seejärel standardkõveraga, et määrata tundmatute proovide valgu kontsentratsioon.
Proovimahu arvutamise põhivalem BCA neeldumise tulemuste põhjal on:
Kus:
Valgu kontsentratsioon arvutatakse neeldumise näidu põhjal standardkõvera valemi abil:
Tüüpilise BCA testi puhul on tavaline kalle umbes 2.0 ja intercept on sageli lähedane nullile, kuigi need väärtused võivad varieeruda sõltuvalt teie konkreetsetest testi tingimustest ja standardkõverast.
Meie kalkulaator lihtsustab proovimahude määramise protsessi BCA testi tulemuste põhjal. Järgige neid samme, et saada täpseid arvutusi:
Sisestage prooviteave:
Valige standardkõvera tüüp:
Vaadake tulemusi:
Kopeeri või eksportige tulemusi:
Vaatame praktilist näidet:
See tähendab, et peaksite laadima 13.33 μL oma proovi, et saada 20 μg valku.
Kalkulaator annab mitmeid olulisi teabepunkte:
Valgu kontsentratsioon: See arvutatakse teie neeldumise näidu põhjal valitud standardkõvera abil. See esindab valgu kogust prooviühiku kohta (μg/μL).
Proovimaht: See on proovimaht, mis sisaldab soovitud valgu kogust. See väärtus on see, mida kasutate oma katsete ettevalmistamisel.
Hoiatused ja soovitused: Kalkulaator võib anda hoiatusi:
Üks levinumaid rakendusi selle kalkulaatori jaoks on proovide ettevalmistamine western blotting'uks. Ühtlane valgu laadimine on usaldusväärsete western blot'i tulemuste jaoks ülioluline, ja see kalkulaator tagab, et laadite iga proovi jaoks sama palju valku, isegi kui nende kontsentratsioonid erinevad.
Näidisvoog:
Ensümaatilistes katsetes on sageli vajalik kasutada kindlat kogust valku, et standardiseerida reaktsioonitingimusi erinevate proovide või katsete vahel.
Näidisvoog:
Immunopretsipitatsiooni (IP) katsetes on oluline alustada ühtse valgu kogusega, et võrrelda tulemusi erinevate tingimuste vahel.
Näidisvoog:
Valgu puhastamise käigus on sageli vajalik jälgida valgu kontsentratsiooni ja arvutada saagid erinevates etappides.
Näidisvoog:
Kuigi kalkulaator pakub vaikimisi parameetreid standardsete BCA testide jaoks, saate sisestada ka kohandatud väärtused, kui olete loonud oma standardkõvera. See on eriti kasulik, kui:
Kohandatud standardkõvera kasutamiseks:
Kalkulaator võimaldab teil lisada mitu proovi ja arvutada nende mahtusid samaaegselt. See on eriti kasulik, kui valmistate proove katseteks, mis nõuavad ühtlast valgu laadimist erinevate tingimuste vahel.
Partii töötlemise eelised:
Kui teie neeldumise näit on üle 2.0, võib see olla BCA testi lineaarse vahemiku väljas. Sellistel juhtudel:
Neeldumise näidud alla 0.1 võivad olla testi tuvastamise piirides, mis võib mõjutada täpsust. Kaaluge:
Kui kalkulaator näitab, et maht on teie rakenduse jaoks liiga suur:
Valgude täpne kvantifitseerimine on olnud põhiline nõue biokeemias ja molekulaarbioloogias alates nende valdkondade tekkimisest. Varased meetodid tuginesid lämmastiku sisalduse määramisele, mis oli aeganõudev ja nõudis spetsialiseeritud seadmeid.
Kjeldahli meetod (1883): Üks varasemaid valgu kvantifitseerimise meetodeid, mis põhineb lämmastiku sisalduse mõõtmisel.
Biureeti test (1900. aastate algus): See meetod tugineb peptiidide sidemete reaktsioonile vaseioonidega aluselises lahuses, mille tulemusena tekib violetne värv.
Lowry test (1951): Oliver Lowry arendas selle meetodi, mis kombineeris biureeti reaktsiooni Folin-Ciocalteu reaktiiviga, suurendades tundlikkust.
Bradfordi test (1976): Marion Bradford arendas selle meetodi, kasutades Coomassie Brilliant Blue G-250 värvi, mis seondub valkudega ja muudab absorptsiooni maksimaalse.
BCA test (1985): Paul Smith ja tema kolleegid Pierce Chemical Company-st arendasid selle meetodi, kombineerides biureeti reaktsiooni BCA tuvastamisega, pakkudes paremat tundlikkust ja ühilduvust detergendidega.
BCA test kirjeldati esmakordselt 1985. aasta artiklis, mille autoriteks olid Smith jt, pealkirjaga "Measurement of protein using bicinchoninic acid." See arendati, et lahendada olemasolevate meetodite piirangud, eriti kemikaalide sekkumine, mida sageli kasutatakse valgu ekstraheerimisel ja puhastamisel.
Peamine uuendus oli kasutada bikinchononic acid'i vaseioonide tuvastamiseks, mis tekivad valgu vahendatud vähendamise tulemusena, moodustades lilla värvi kompleksi, mida saab spektrofotomeetriliselt mõõta. See pakkus mitmeid eeliseid:
Alates selle tutvustamisest on BCA testist saanud üks laialdaselt kasutatavaid valgu kvantifitseerimise meetodeid biokeemia ja molekulaarbioloogia laborites üle kogu maailma.
1=IF(B2<=0,"Viga: Kehtetu neeldumine",IF(C2<=0,"Viga: Kehtetu proovimass",C2/(2*B2)))
2
3' Kus:
4' B2 sisaldab neeldumise näitu
5' C2 sisaldab soovitud proovimassi μg-des
6' Valem tagastab vajaliku proovimahu μL-des
71import numpy as np
2import matplotlib.pyplot as plt
3
4def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=2.0, intercept=0):
5 """Arvuta valgu kontsentratsioon neeldumise põhjal standardkõvera abil."""
6 if absorbance < 0:
7 raise ValueError("Neeldumine ei saa olla negatiivne")
8 return (slope * absorbance) + intercept
9
10def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=2.0, intercept=0):
11 """Arvuta vajalik proovimaht, tuginedes neeldumisele ja soovitud massile."""
12 if sample_mass <= 0:
13 raise ValueError("Proovimass peab olema positiivne")
14
15 protein_concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if protein_concentration <= 0:
18 raise ValueError("Arvutatud valgu kontsentratsioon peab olema positiivne")
19
20 return sample_mass / protein_concentration
21
22# Näidis kasutamine
23absorbance = 0.75
24sample_mass = 20 # μg
25slope = 2.0
26intercept = 0
27
28try:
29 volume = calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
30 print(f"Neeldumise {absorbance} ja soovitud valgu massi {sample_mass} μg korral:")
31 print(f"Valgu kontsentratsioon: {calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept):.2f} μg/μL")
32 print(f"Vajalik proovimaht: {volume:.2f} μL")
33except ValueError as e:
34 print(f"Viga: {e}")
351# Funktsioon valgu kontsentratsiooni arvutamiseks neeldumise põhjal
2calculate_protein_concentration <- function(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
3 if (absorbance < 0) {
4 stop("Neeldumine ei saa olla negatiivne")
5 }
6 return((slope * absorbance) + intercept)
7}
8
9# Funktsioon proovimahu arvutamiseks
10calculate_sample_volume <- function(absorbance, sample_mass, slope = 2.0, intercept = 0) {
11 if (sample_mass <= 0) {
12 stop("Proovimass peab olema positiivne")
13 }
14
15 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if (protein_concentration <= 0) {
18 stop("Arvutatud valgu kontsentratsioon peab olema positiivne")
19 }
20
21 return(sample_mass / protein_concentration)
22}
23
24# Näidis kasutamine
25absorbance <- 0.75
26sample_mass <- 20 # μg
27slope <- 2.0
28intercept <- 0
29
30tryCatch({
31 volume <- calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
32 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
33
34 cat(sprintf("Neeldumise %.2f ja soovitud valgu massi %.2f μg korral:\n", absorbance, sample_mass))
35 cat(sprintf("Valgu kontsentratsioon: %.2f μg/μL\n", protein_concentration))
36 cat(sprintf("Vajalik proovimaht: %.2f μL\n", volume))
37}, error = function(e) {
38 cat(sprintf("Viga: %s\n", e$message))
39})
401function calculateProteinConcentration(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
2 if (absorbance < 0) {
3 throw new Error("Neeldumine ei saa olla negatiivne");
4 }
5 return (slope * absorbance) + intercept;
6}
7
8function calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope = 2.0, intercept = 0) {
9 if (sampleMass <= 0) {
10 throw new Error("Proovimass peab olema positiivne");
11 }
12
13 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
14
15 if (proteinConcentration <= 0) {
16 throw new Error("Arvutatud valgu kontsentratsioon peab olema positiivne");
17 }
18
19 return sampleMass / proteinConcentration;
20}
21
22// Näidis kasutamine
23try {
24 const absorbance = 0.75;
25 const sampleMass = 20; // μg
26 const slope = 2.0;
27 const intercept = 0;
28
29 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
30 const volume = calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope, intercept);
31
32 console.log(`Neeldumise ${absorbance} ja soovitud valgu massi ${sampleMass} μg korral:`);
33 console.log(`Valgu kontsentratsioon: ${proteinConcentration.toFixed(2)} μg/μL`);
34 console.log(`Vajalik proovimaht: ${volume.toFixed(2)} μL`);
35} catch (error) {
36 console.error(`Viga: ${error.message}`);
37}
38Seos neeldumise ja valgu kontsentratsiooni vahel on tavaliselt lineaarne teatud vahemikus. Allpool on visualiseerimine BCA standardkõverast:
<text x="150" y="370">0.5</text>
<line x1="150" y1="350" x2="150" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="250" y="370">1.0</text>
<line x1="250" y1="350" x2="250" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="350" y="370">1.5</text>
<line x1="350" y1="350" x2="350" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="450" y="370">2.0</text>
<line x1="450" y1="350" x2="450" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="550" y="370">2.5</text>
<line x1="550" y1="350" x2="550" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="300">1.0</text>
<line x1="45" y1="300" x2="50" y2="300" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="250">2.0</text>
<line x1="45" y1="250" x2="50" y2="250" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="200">3.0</text>
<line x1="45" y1="200" x2="50" y2="200" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="150">4.0</text>
<line x1="45" y1="150" x2="50" y2="150" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="100">5.0</text>
<line x1="45" y1="100" x2="50" y2="100" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="50">6.0</text>
<line x1="45" y1="50" x2="50" y2="50" stroke="#64748b"/>
Erinevatel valgu kvantifitseerimise meetoditel on erinevad eelised ja piirangud. Siin on, kuidas BCA test võrreldes teiste levinud meetoditega:
| Meetod | Tundlikkuse vahemik | Eelised | Piirangud | Parim |
|---|---|---|---|---|
| BCA test | 5-2000 μg/mL | • Ühilduv detergendidega • Vähem valgu-vaheline variatsioon • Stabiilne värvi areng | • Vähendavad ained võivad sekkuda • Mõned keemilised ained võivad mõjutada | • Üldine valgu kvantifitseerimine • Proovid, mis sisaldavad detergente |
| Bradfordi test | 1-1500 μg/mL | • Kiire (2-5 min) • Vähe sekkumise aineid | • Suur valgu-vaheline variatsioon • Ühilduv detergendidega | • Kiired mõõtmised • Detergendivabad proovid |
| Lowry meetod | 1-1500 μg/mL | • Hästi väljakujunenud • Hea tundlikkus | • Palju sekkumise aineid • Mitmed sammud | • Ajalooline järjepidevus • Puhtad valgu proovid |
| UV neeldumine (280 nm) | 20-3000 μg/mL | • Mittehävitav • Väga kiire • Ei ole vaja reaktiive | • Mõjutavad nukleiinhappeid • Nõuab puhtaid proove | • Puhtad valgu lahendused • Kiired kontrollid puhastamise ajal |
| Fluoromeetriline | 0.1-500 μg/mL | • Kõrgeim tundlikkus • Lai dünaamiline vahemik | • Kallid reaktiivid • Nõuab fluoromeetrit | • Väga lahjad proovid • Piiratud proovimaht |
BCA (bikinchoninic acid) testi kasutatakse peamiselt lahuses oleva valgu kogukontsentratsiooni kvantifitseerimiseks. Seda kasutatakse laialdaselt biokeemias, rakkude bioloogias ja molekulaarbioloogias rakendustes nagu western blotting, ensümaatilised katsed, immunopretsipitatsioon ja valgu puhastamine.
BCA test on tavaliselt täpne 5-10% ulatuses, kui seda tehakse õigesti. Selle täpsus sõltub mitmest tegurist, sealhulgas standardkõvera kvaliteedist, sekkumise ainete puudumisest ja kas tundmatu valgu koostis on sarnane kasutatud standardvalgu omaga.
Mitmed ained võivad BCA testi tulemusi mõjutada, sealhulgas:
Peamised erinevused on:
Kui teie kalkulaator näitab väga suurt proovimahtu, näitab see tavaliselt madalat valgu kontsentratsiooni teie proovis. See võib olla tingitud:
Kaaluge oma proovi kontsentreerimist või kohandage oma katse disaini madalamate valgu kontsentratsioonide jaoks.
See kalkulaator on spetsiaalselt loodud BCA testi tulemuste jaoks. Kuigi põhialus (kontsentratsiooni muutmine mahuks) kehtib ka teiste meetodite puhul, varieerub neeldumise ja valgu kontsentratsiooni suhe erinevate testide vahel. Teiste meetodite, nagu Bradfordi või Lowry, jaoks peate kasutama erinevaid standardkõvera parameetreid.
Neeldumise näitude puhul, mis on väljaspool lineaarset vahemikku (tavaliselt >2.0):
Bovina serum albumiin (BSA) on kõige sagedamini kasutatav standard BCA testides, kuna see on:
Kuid kui teie proovid sisaldavad domineerivat valku, mis erineb oluliselt BSA-st, kaaluge selle valgu kasutamist oma standardina täpsemate tulemuste saavutamiseks.
BCA reaktsioonis tekkinud lilla värv on toatemperatuuril stabiilne mitu tundi ja seda saab mõõta igal ajal selle perioodi jooksul. Siiski on soovitatav mõõta kõiki standardeid ja proove ligikaudu samal ajal pärast värvi arengut.
Kuigi tehniliselt on võimalik eelmist standardkõverat uuesti kasutada, ei soovitata seda täpsete kvantifitseerimise tulemuste jaoks. Reaktiivide, inkubeerimise tingimuste ja seadme kalibreerimise variatsioonid võivad mõjutada neeldumise ja valgu kontsentratsiooni vahelist seost. Usaldusväärsete tulemuste saamiseks genereerige iga kord värske standardkõver.
Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, et al. "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Analytical Biochemistry. 1985;150(1):76-85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7
Thermo Scientific. "Pierce BCA Protein Assay Kit." Juhised. Saadaval aadressil: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf
Walker JM. "The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation." In: Walker JM, ed. The Protein Protocols Handbook. Springer; 2009:11-15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3
Olson BJ, Markwell J. "Assays for determination of protein concentration." Current Protocols in Protein Science. 2007;Chapter 3:Unit 3.4. doi:10.1002/0471140864.ps0304s48
Noble JE, Bailey MJ. "Quantitation of protein." Methods in Enzymology. 2009;463:73-95. doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1
Nüüd, kui mõistate BCA valgu kvantifitseerimise ja proovimahu arvutamise põhimõtteid, proovige meie kalkulaatorit, et lihtsustada oma labori töövoogu. Lihtsalt sisestage oma neeldumise näidud ja soovitud proovimass, et saada koheseid, täpseid proovimahu arvutusi.
Olgu need teie proovide ettevalmistamine western blotting'uks, ensümaatiliste katsete tegemine või mõni muu valgu põhine katse, meie kalkulaator aitab tagada järjepidevad ja usaldusväärsed tulemused. Säästke aega, vähendage vigu ja parandage oma katsete korduvust BCA Absorbance Sample Volume Calculatoriga.
Avasta rohkem tööriistu, mis võivad olla kasulikud teie töövoos