BCA proovi mahukalkuaator | Valgu kvantifitseerimise tööriist

Mis on BCA proovimahtu arvutav kalkulaator

BCA proovimahtu arvutav kalkulaator teisendab BCA valgutesti neeldumuse näidu proovi mahuks mikroliitrites (μL), mis on vajalik sihtkoguse valgu laadimiseks. Seda kasutatakse pärast bitsinkoniinhappe (BCA) valgutesti tegemist. See on levinud laborianalüüs, millega mõõdetakse lahuses oleva valgu kogust selle järgi, kui palju lillat valgust neelavat värvust proov tekitab.

Kuidas BCA-test valku mõõdab

BCA-test toimub kahes etapis. Esiteks redutseerib proovis olev valk aluselises lahuses vaseioonid (Cu²⁺) teistsuguseks vormiks (Cu¹⁺). Redutseerumise määr sõltub valgu kogusest. Teiseks seondub bitsinkoniinhape redutseeritud vasega ja moodustab lilla ühendi, mis neelab valgust tugevalt lainepikkusel 562 nanomeetrit (nm).

Spektrofotomeeter mõõdab, kui palju valgust proov lainepikkusel 562 nm neelab. Seda näitu nimetatakse neeldumuseks. Tumedam lilla värvus tähendab suuremat neeldumust ja suuremat valgukogust. Labor võrdleb iga proovi neeldumust standardkõveraga, mis koostatakse teadaolevate kontsentratsioonidega võrdlusvalgu, tavaliselt veise seerumi albumiini (BSA), mõõtmise põhjal.

BCA on populaarne, sest see toimib ka siis, kui proov sisaldab detergente, näiteks SDS-i või Triton X-100, mis on rakkude lüüsipuhvrites tavalised kemikaalid, kuid rikuvad kaks vanemat analüüsi: Bradfordi ja Lowry meetodi.

BCA neeldumuse teisendamine proovimahtu

BCA standardkõver on sirge, mis sobitatakse neeldumuse ja kontsentratsiooni vahelisele seosele:

$\text{Neeldumus} = \text{Tõus} \times \text{Kontsentratsioon} + \text{Vabaliige}$

Mõõdetud neeldumusest valgukontsentratsioonini jõudmiseks pööratakse võrrand ümber:

$\text{Valgukontsentratsioon (μg/μL)} = \frac{\text{Neeldumus} - \text{Vabaliige}}{\text{Tõus}}$

Kui kontsentratsioon on teada, arvutatakse sihtmassiga valgukogust sisaldava proovi maht järgmiselt:

$\text{Proovi maht (μL)} = \frac{\text{Proovi mass (μg)}}{\text{Valgukontsentratsioon (μg/μL)}}$

Kalkulaator pakub nelja eelseadistatud kõveratüüpi, millest igaühel on erinev tõus ja vabaliige. Vabaliige on kõigis eelseadistustes 0, sest näidud on tühikorrektuuriga: valguta kontrollproovi neeldumus lahutatakse esmalt. Tõus kajastab, kui suurt osa plaadi neeldumisvahemikust hõlmab iga protokolli töövahemik.

Lahjendatud proovide jaoks mõeldud tundlikum protokoll tekitab iga valgu mikrogrammi kohta suurema neeldumuse, mistõttu on selle tõus suurem. Tõhustatud BCA ja mikro-BCA sobivad proovidele, mis on standardse protokolli täpseks mõõtmiseks liiga lahjad.

Kuidas arvutada BCA neeldumuse põhjal proovimahtu

1. Tehke BCA-test ja mõõtke iga proovi neeldumust lainepikkusel 562 nm.
2. Valige kasutatud protokollile vastav kõveratüüp (standardne, tõhustatud või mikro-BCA) või sisestage samal päeval koostatud kõverast saadud kohandatud tõus ja vabaliige.
3. Sisestage iga proovi neeldumus ja sihtvalgumass mikrogrammides.
4. Kalkulaator teisendab neeldumuse valgukontsentratsiooniks ja jagab seejärel sihtmassi selle kontsentratsiooniga, et saada pipeteeritav maht.

Näide: proovimahtu arvutamine BCA neeldumuse põhjal

Western-blotti ette valmistav teadlane vajab 20 μg valku raja kohta ja kasutab standardset BCA-kõverat (tõus 1,0, vabaliige 0).

Proov A annab neeldumuseks 0,75:

• Valgukontsentratsioon = (0,75 − 0) / 1,0 = 0,75 μg/μL
• Proovi maht = 20 μg ÷ 0,75 μg/μL = 26,67 μL

Proov B annab neeldumuseks 1,2:

• Valgukontsentratsioon = (1,2 − 0) / 1,0 = 1,2 μg/μL
• Proovi maht = 20 μg ÷ 1,2 μg/μL = 16,67 μL

Proov A on lahjem, seega on sama 20 μg sihtkoguse saavutamiseks vaja suuremat mahtu.

Kalkulaatori tulemuste mõistmine

Kalkulaator esitab iga proovi kohta kaks arvu: valgukontsentratsiooni ühikutes μg/μL ja proovimahtu ühikutes μL. Samuti märgib see tulemused, mis võivad probleeme põhjustada:

• Neeldumus üle 3,0 annab hoiatuse, sest tüüpilised BCA näidud jäävad vahemikku 0 kuni 2,0.
• Neeldumus alla 0,05 (kuid üle nulli) annab hoiatuse, et tulemus võib olla vähem täpne, sest nõrk signaal on mõõtemüra suhtes tundlikum.
• Arvutatud maht 1000 μL või rohkem annab hoiatuse kasutada kontsentreeritumat proovi.
• Arvutatud maht alla 0,5 μL annab hoiatuse, et seda võib olla raske täpselt pipeteerida.
• Negatiivne neeldumus või negatiivne proovimass lükatakse kohe tagasi.

Praktilised laborikasutused

Valgu ühtlane laadimine on western-bloti üks levinumaid ebaõnnestumise põhjuseid: radade ebaühtlane bändide intensiivsus peegeldab sageli valgu ebavõrdset laadimist, mitte tegelikke ekspressioonierinevusi. Iga proovi neeldumusnäidu põhjal täpse mahu arvutamine hoiab laadimise kogu geelis ühtlasena.

Sama arvutus kehtib ensüümanalüüside puhul, kus aktiivsuse võrdlemiseks eri tingimustes tuleb alustada võrdse üldvalgukogusega, ning immunosadestamise puhul, kus ebavõrdne sisestatud valgukogus (näiteks 800 μg ühes katsutis ja 1200 μg teises) muudab tulemuste võrdlemise raskeks. Valgu puhastamisel kasutatakse sama valemit igas etapis, et jälgida, kui palju valku jõuab igasse fraktsiooni.

Võrdlus teiste valgutestidega

Valgu kvantifitseerimise lühiajalugu

Varajane valgumõõtmine põhines Kjeldahli meetodil (1883), millega mõõdeti lämmastikusisaldust pärast proovi lagundamist happes. 1900. aastate alguses välja töötatud biureeditest kasutas peptiidsidemete ja vaseioonide vahelist värvusreaktsiooni, kuid polnud kuigi tundlik. Oliver Lowry ühendas 1951 biureedireaktsiooni täiendava reagendiga, luues Lowry meetodi, mis domineeris valgumõõtmises aastakümneid, hoolimata sellest, et tavalised laborikemikaalid, näiteks detergendid ja EDTA, seda häirisid. Marion Bradford tutvustas 1976 kiiremat värvi sidumise meetodit, kuid ka see ei toiminud detergentide juuresolekul ning tulemus varieerus sõltuvalt valgu aminohappelisest koostisest. Paul Smith ja kolleegid Pierce Chemical Companyst avaldasid BCA-meetodi 1985, ühendades biureedikeemia bitsinkoniinhappe suurema tundlikkusega vase suhtes. Nii loodi analüüs, mis talub tüüpilistes rakkude lüsaadides leiduvaid detergente.

Koodinäide

1def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=1.0, intercept=0):
2    """Convert a BCA absorbance reading to protein concentration (ug/uL)."""
3    if absorbance < 0:
4        raise ValueError("Absorbance cannot be negative")
5    if slope == 0:
6        raise ValueError("Slope cannot be zero")
7    return (absorbance - intercept) / slope
8
9def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=1.0, intercept=0):
10    """Calculate the sample volume (uL) needed for a target protein mass (ug)."""
11    if sample_mass <= 0:
12        raise ValueError("Sample mass must be positive")
13    concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
14    if concentration <= 0:
15        raise ValueError("Calculated protein concentration must be positive")
16    return sample_mass / concentration
17
18# Standard BCA curve (slope 1.0, intercept 0)
19volume = calculate_sample_volume(absorbance=0.75, sample_mass=20)
20print(f"{volume:.2f} uL")  # 26.67 uL
21

Korduma kippuvad küsimused

Milleks BCA-testi kasutatakse? See mõõdab lahuses oleva üldvalgukontsentratsiooni, enamasti enne võrdsete valgukoguste laadimist western-blotti, enne ensüümiaktiivsuse analüüside normaliseerimist või valgu puhastamisel saagise jälgimiseks.

Kui täpne on BCA-test? Heades tingimustes on tulemused tavaliselt täpsed vahemikus 5–10%, eeldusel et standardkõveral on vähemalt viis või kuus punkti ja proov ei sisalda häirivat ainet suures kontsentratsioonis.

Mis häirib BCA-testi tulemusi? Redutseerivad ained, sealhulgas DTT ja β-merkaptoetanool, suurendavad neeldumust kunstlikult, sest redutseerivad vaske valgust sõltumatult. Kelaativad ained, näiteks EDTA, vähendavad neeldumust, sidudes vase enne selle reageerimist.

Mis vahe on BCA- ja Bradfordi testil? Bradfordi test annab tulemuse umbes viie minutiga, kuid detergendid häirivad seda ning tulemus sõltub valgu aminohappelisest koostisest. BCA-test võtab umbes 30 minutit, kuid talub detergente ja annab eri valkude puhul ühtlasemaid näite, mistõttu sobib see rakkude lüsaadile paremini.

Miks on arvutatud proovimahu ebatavaliselt suur? Suur maht tähendab, et mõõdetud valgukontsentratsioon on oodatust väiksem. Levinud põhjused on rakkude mittetäielik lüüs, liiga lahjendatud proov või analüüsi alumise avastamispiiri lähedane neeldumusnäit. Proovi kontsentreerimine tsentrifuugfiltriga või üleminek tõhustatud või mikro-BCA-protokollile lahendab selle tavaliselt.

Mida teha, kui neeldumus jääb lineaarsest vahemikust välja? Lahjendage proovi ja mõõtke see uuesti. Neeldumuse ja kontsentratsiooni vaheline seos laguneb ligikaudu üle 2,0, mistõttu standardkõverast kaugemale ekstrapoleerimine alahindab tegelikku kontsentratsiooni.

Viited

1. Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT jt. „Measurement of protein using bicinchoninic acid.“ Analytical Biochemistry. 1985;150(1):76-85.
2. Thermo Fisher Scientific. „Pierce BCA Protein Assay Kit“ kasutusjuhend (MAN0011430).
3. Bradford MM. „A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein.“ Analytical Biochemistry. 1976;72(1-2):248-254.