محاسبه‌گر دمای اتصال DNA | ابزار رایگان Tm برای PCR

محاسبه‌گر دمای آنیلینگ DNA چیست؟

محاسبه‌گر دمای اتصال DNA، دمای ذوب (Tm) یک پرایمر DNA را بر اساس توالی آن برآورد می‌کند. Tm دمایی است که در آن نیمی از مولکول‌های پرایمر به رشته هدف خود متصل‌اند و نیمی متصل نیستند. در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR)، این مقدار دمای مورد استفاده برای اتصال پرایمرها به الگوی DNA را تعیین می‌کند.

چرا دمای اتصال در PCR اهمیت دارد؟

PCR با چرخه‌های مکرر گرم‌کردن و سردکردن، قطعه هدف DNA را تکثیر می‌کند. هر چرخه سه مرحله دارد. ابتدا، گرما الگوی دورشته‌ای را در حدود ۹۵ °C از هم جدا می‌کند. این مرحله واسرشت‌سازی نام دارد. سپس واکنش تا دمای اتصال، که معمولاً بین ۵۰ °C و ۶۵ °C است، سرد می‌شود تا پرایمرهای کوتاه بتوانند به توالی‌های مکملِ خود روی رشته‌های تک‌رشته‌ای متصل شوند. در مرحله سوم، دما به حدود ۷۲ °C می‌رسد و آنزیمی به نام DNA پلیمراز، پرایمرها را امتداد می‌دهد تا رشته‌های جدید DNA ساخته شوند.

اگر دمای اتصال خیلی پایین باشد، پرایمرها به توالی‌هایی متصل می‌شوند که فقط تا حدی مطابقت دارند و قطعات اضافی و ناخواسته DNA تولید می‌شود. اگر دما خیلی بالا باشد، پرایمرها نمی‌توانند پیوند پایداری با الگو تشکیل دهند و DNA کمی یا اصلاً تکثیر نمی‌شود. دمای اتصال یکی از نخستین تنظیماتی است که پژوهشگران هنگام شکست واکنش PCR تغییر می‌دهند.

محتوای GC چگونه بر Tm اثر می‌گذارد؟

پرایمر از طریق پیوندهای هیدروژنی با هدف خود جفت می‌شود. یک جفت گوانین–سیتوزین (G-C) سه پیوند هیدروژنی تشکیل می‌دهد. یک جفت آدنین–تیمین (A-T) دو پیوند تشکیل می‌دهد. پرایمری که بازهای G و C بیشتری دارد، برای جدا شدن دو رشته به گرمای بیشتری نیاز دارد؛ بنابراین Tm آن از پرایمری با طول یکسان و بازهای A و T بیشتر، بالاتر است. محتوای GC معمولاً به‌صورت درصد نوشته می‌شود: تعداد بازهای G و C تقسیم بر طول کل توالی، ضربدر ۱۰۰.

فرمول دمای اتصال DNA

این محاسبه‌گر یکی از دو فرمول را بر اساس طول پرایمر به کار می‌برد.

برای پرایمرهای دارای ۱۴ نوکلئوتید یا بیشتر، از فرمول محتوای GC مارمور–دوتی استفاده می‌کند:

$Tm = 64.9 + 41 \times \frac{(N_{GC} - 16.4)}{N}$

در اینجا N_GC تعداد بازهای G و C در پرایمر است که مستقیماً شمارش می‌شود، نه به‌صورت درصد. N تعداد کل بازهاست.

برای پرایمرهای کوتاه‌تر از ۱۴ نوکلئوتید، از قاعده والاس استفاده می‌کند:

$Tm = 2 \times (A + T) + 4 \times (G + C)$

A، T، G و C هرکدام نشان‌دهنده تعداد همان باز در پرایمر هستند.

هر دو فرمول شرایط معمول PCR را فرض می‌کنند: حدود ۵۰ نانومولار پرایمر و ۵۰ میلی‌مولار Na+.

مثال حل‌شده

پرایمر ۱۹-بازی ATGCTAGCTAGCTGCTAGC را در نظر بگیرید. طول آن ۱۹ است که ۱۴ یا بیشتر محسوب می‌شود؛ بنابراین محاسبه‌گر از فرمول مارمور–دوتی استفاده می‌کند.

• طول (N) = ۱۹
• تعداد G برابر ۵ است، تعداد C برابر ۵ است؛ بنابراین N_GC = ۱۰ و محتوای GC برابر ۱۰ / ۱۹ × ۱۰۰ ≈ ۵۲٫۶٪ است
• Tm = ۶۴٫۹ + ۴۱ × (۱۰ − ۱۶٫۴) / ۱۹ = ۶۴٫۹ + ۴۱ × (−۶٫۴) / ۱۹ = ۶۴٫۹ − ۱۳٫۸ ≈ ۵۱٫۱ °C

در فرمول از تعداد GC، یعنی ۱۰، استفاده می‌شود، نه درصد GC، یعنی ۵۲٫۶. استفاده اشتباه از درصد، مقدار Tm را نزدیک ۱۴۳ °C به دست می‌دهد که برای واکنش PCR در حال اجرا بین ۵۰ °C و ۹۵ °C واقع‌بینانه نیست.

روش استفاده از این محاسبه‌گر

توالی پرایمر را فقط با استفاده از حروف A، T، G و C وارد یا جای‌گذاری کنید. محاسبه‌گر طول توالی را بر حسب نوکلئوتید (nt)، محتوای GC را به‌صورت درصد، و دمای اتصال محاسبه‌شده را بر حسب درجه سلسیوس نشان می‌دهد. نتیجه را می‌توان برای یادداشت‌های آزمایشگاه یا پروتکل کپی کرد.

انتخاب دمای اتصال PCR

Tm یک برآورد محاسبه‌شده است، نه دمای کاری تضمین‌شده. بسیاری از پروتکل‌های PCR مرحله اتصال واقعی را چند درجه پایین‌تر از Tm محاسبه‌شده آغاز می‌کنند و سپس بر اساس نتیجه روی ژل آن را تنظیم می‌کنند. برای یک جفت پرایمر، معمولاً مقدار Tm پرایمری که Tm پایین‌تری دارد، به‌عنوان نقطه شروع استفاده می‌شود. PCR گرادیانی، که چند واکنش را هم‌زمان در دامنه‌ای از دماها اجرا می‌کند، روش رایجی برای یافتن بهترین دما از طریق آزمون است.

روش‌های دیگر برآورد Tm

فرمول‌های مارمور–دوتی و والاس که در اینجا به کار رفته‌اند، تقریب‌های سریعی هستند که فقط بر ترکیب بازها تکیه دارند. روش‌های دیگری نیز وجود دارد:

• ترمودینامیک نزدیک‌ترین همسایه، اثر هر جفت باز مجاور بر پایداری را در نظر می‌گیرد و برای پرایمرهای استاندارد، روش دقیق‌تری محسوب می‌شود.
• فرمول‌های اصلاح‌شده بر اساس نمک، اصلاحی را برای غلظت یون‌های Na+ یا K+ در بافر واکنش اضافه می‌کنند؛ زیرا غلظت بیشتر نمک، دوپلکس DNA را پایدارتر می‌کند و Tm را افزایش می‌دهد.

محاسبه‌گرهای مختلف ممکن است برای یک پرایمر یکسان، مقادیر متفاوتی از Tm گزارش کنند، زیرا از فرمول‌های متفاوتی استفاده می‌کنند. اجرای PCR و بررسی نتیجه همچنان آزمون نهایی است.

پرسش‌های متداول

دمای اتصال DNA چیست؟

دمایی است که در آن پرایمرهای DNA هنگام PCR به توالی متناظر با خود روی یک رشته الگو متصل می‌شوند. آزمایشگاه‌ها معمولاً آن را چند درجه پایین‌تر از دمای ذوب (Tm) محاسبه‌شده پرایمر تنظیم می‌کنند.

Tm پرایمر چگونه محاسبه می‌شود؟

برای پرایمرهای دارای ۱۴ باز یا بیشتر، Tm = ۶۴٫۹ + ۴۱ × (تعداد GC − ۱۶٫۴) / طول. برای پرایمرهای کوتاه‌تر از ۱۴ باز، Tm = ۲ × (تعداد A+T) + ۴ × (تعداد G+C).

چرا محتوای GC باعث افزایش Tm می‌شود؟

جفت‌های بازی G-C سه پیوند هیدروژنی تشکیل می‌دهند، درحالی‌که جفت‌های A-T دو پیوند دارند. پرایمری که سهم بیشتری از بازهای G و C دارد، برای جداشدن از هدف خود به انرژی بیشتر و در نتیجه دمای بالاتری نیاز دارد.

آیا دمای اتصال PCR باید با Tm محاسبه‌شده برابر باشد؟

خیر. بیشتر پروتکل‌ها کار را چند درجه پایین‌تر از Tm محاسبه‌شده آغاز می‌کنند و سپس دما را از آن نقطه تنظیم می‌کنند، زیرا Tm نقطه‌ای را نشان می‌دهد که فقط نیمی از پرایمر متصل است.

آیا طول پرایمر Tm را تغییر می‌دهد؟

بله، هرچند این رابطه ساده نیست. طول در مخرج فرمول مارمور–دوتی قرار دارد؛ بنابراین یک پرایمر بلندتر با محتوای GC متوسط، لزوماً Tm بالاتری از پرایمری کوتاه‌تر و غنی از GC ندارد.

چرا محاسبه‌گرهای مختلف Tm با هم اختلاف دارند؟

آن‌ها از فرمول‌های متفاوتی استفاده می‌کنند. قاعده والاس، فرمول محتوای GC مارمور–دوتی، ترمودینامیک نزدیک‌ترین همسایه و فرمول‌های اصلاح‌شده بر اساس نمک، هرکدام می‌توانند برای یک پرایمر یکسان Tm متفاوتی بدهند؛ گاهی اختلاف آن‌ها چند درجه است.

منابع

1. Marmur J, Doty P. تعیین ترکیب بازهای اسید دئوکسی‌ریبونوکلئیک بر اساس دمای واسرشت‌سازی حرارتی آن. J Mol Biol. ۱۹۶۲;۵(۱):۱۰۹-۱۱۸.
2. Wallace RB, Shaffer J, Murphy RF, Bonner J, Hirose T, Itakura K. هیبریداسیون الیگودئوکسی‌ریبونوکلئوتیدهای مصنوعی با DNA فاژی phi chi ۱۷۴. Nucleic Acids Res. ۱۹۷۹;۶(۱۱):۳۵۴۳-۳۵۵۷.
3. SantaLucia J Jr. دیدگاهی یکپارچه درباره ترمودینامیک همسایه‌های نزدیک در DNAهای پلیمری، دمبلی و الیگونوکلئوتیدی. Proc Natl Acad Sci U S A. ۱۹۹۸;۹۵(۴):۱۴۶۰-۱۴۶۵.