محاسبه‌گر کارایی qPCR: ابزار تحلیل منحنی استاندارد

ماشین‌حساب کارایی qPCR

ماشین‌حساب کارایی qPCR برآورد می‌کند که واکنش PCR کمی (qPCR) در هر چرخهٔ تکثیر، توالی DNA هدف را تا چه اندازه به‌خوبی کپی می‌کند. این ابزار با استفاده از مقادیر Ct (شمارهٔ چرخه‌ای که در آن سیگنال فلورسانس از آستانهٔ تعیین‌شده عبور می‌کند) از یک سری رقت، کارایی، شیب، عرض از مبدأ و R² را محاسبه می‌کند.

کارایی qPCR چیست؟

PCR کمی، فلورسانس را در حالی که واکنش توالی DNA هدف را چرخه‌به‌چرخه کپی می‌کند، ردیابی می‌کند. کارایی تکثیر نشان می‌دهد مقدار DNA هدف در هر چرخه چه میزان افزایش می‌یابد. در کارایی ۱۰۰٪، مقدار DNA هدف در هر چرخه دو برابر می‌شود.

واکنش‌های واقعی به‌ندرت دقیقاً به کارایی ۱۰۰٪ می‌رسند. بیشتر آزمایشگاه‌ها کارایی بین ۹۰٪ و ۱۱۰٪ را برای کمّی‌سازی قابل‌اعتماد قابل‌قبول می‌دانند. مقدار کمتر از ۹۰٪ یا بیشتر از ۱۱۰٪ به مشکلی مانند طراحی نامناسب پرایمر، مهارکننده‌های PCR باقی‌مانده از استخراج نمونه یا خطاهای پیپت‌کردن در سری رقت اشاره دارد.

کارایی هنگام مقایسهٔ بیان ژن بین نمونه‌ها بیشترین اهمیت را دارد. روش رایج ΔΔCt برای محاسبهٔ تغییر چندبرابری فرض می‌کند همهٔ واکنش‌ها با کارایی ۱۰۰٪ انجام می‌شوند. وقتی کارایی اندازه‌گیری‌شده با ۱۰۰٪ تفاوت داشته باشد، یا وقتی یک ژن هدف و یک ژن مرجع کارایی‌های متفاوتی داشته باشند، نتایج تغییر چندبرابری ممکن است نادرست باشند.

فرمول کارایی qPCR

کارایی از شیب منحنی استاندارد محاسبه می‌شود؛ این منحنی خطی است که با رسم مقادیر Ct در برابر لگاریتم پایهٔ 10 (log10) مقدار DNA آغازین در یک سری رقت به‌دست می‌آید.

E = ۱۰^(-۱/slope) - ۱

E کارایی است که به‌صورت اعشاری بیان می‌شود (برای تبدیل به درصد، آن را در ۱۰۰ ضرب کنید). شیب، شیب خط منحنی استاندارد است. این مقدار منفی است، زیرا با کاهش مقدار DNA آغازین، Ct افزایش می‌یابد.

شیب -۳٫۳۲ متناظر با کارایی ۱۰۰٪ است:

۱۰^(-۱/-۳٫۳۲) - ۱ = 10^0.301–۱ ≈ ۱٫۰۰

دلیل آن این است که رقت ده‌برابری ۱۰ باید در صورتی که واکنش DNA را در هر چرخه دو برابر کند، Ct را حدود ۳٫۳۲ چرخه جابه‌جا کند؛ زیرا log2(۱۰) تقریباً برابر با ۳٫۳۲ است.

در عمل، شیب بین -۳٫۱ و -۳٫۶ قابل‌قبول در نظر گرفته می‌شود. این بازه متناظر با کارایی تقریباً ۹۰٪ تا ۱۱۰٪ است. شیب نزدیک‌تر به -۳٫۱ کارایی محاسبه‌شدهٔ بیشتری می‌دهد؛ شیب نزدیک‌تر به -۳٫۶ کارایی کمتری ایجاد می‌کند.

نحوهٔ محاسبهٔ کارایی qPCR: روش منحنی استاندارد

1. یک سری رقت آماده کنید. از غلیظ‌ترین نمونه شروع کنید و آن را برای هر نمونهٔ بعدی با یک ضریب ثابت، معمولاً ۱۰ برابر، رقیق کنید. روی هر رقت qPCR انجام دهید و مقدار Ct آن را ثبت کنید.
2. هر رقت را به مقدار log10 تبدیل کنید. اگر نخستین و غلیظ‌ترین نمونه را در موقعیت ۰ در نظر بگیریم، نمونهٔ شمارهٔ i دارای log10(مقدار نسبی) برابر با -i × log10(ضریب رقت) است.
3. برای هر رقت، Ct را روی محور عمودی و مقدار log10 را روی محور افقی رسم کنید و رگرسیون خطی انجام دهید.
4. شیب، عرض از مبدأ و R² خط رگرسیون را به‌دست آورید.
5. شیب را در فرمول E = ۱۰^(-۱/slope) - ۱ قرار دهید تا کارایی به‌دست آید.

معیارهای کیفیت منحنی استاندارد

• R² حداقل ۰٫۹۸. این مقدار نشان می‌دهد نقاط تا چه حد با یک خط راست برازش دارند. مقدار کمتر اغلب به خطاهای پیپت‌کردن یا تکثیر ناهماهنگ اشاره می‌کند.
• شیب بین -۳٫۱ و -۳٫۶. این بازه متناظر با کارایی ۹۰–۱۱۰% است.
• حداقل سه نقطهٔ رقت. پنج یا شش نقطه خط قابل‌اعتمادتری ایجاد می‌کنند و شناسایی نقطهٔ پرت را آسان‌تر می‌سازند.
• Ct غلیظ‌ترین نمونه باید حدود ۱۵-۲۰ باشد. Ct رقیق‌ترین نمونه باید کمتر از ۳۵ بماند، زیرا مقادیر بالاتر به حد تشخیص نزدیک می‌شوند.

مثال حل‌شده

یک سری رقت پنج‌نقطه‌ای با رقت ۱۰ برابر، از غلیظ‌ترین تا رقیق‌ترین نمونه، این مقادیر Ct را می‌دهد: ۱۵٫۰، ۱۸٫۵، ۲۲٫۰، ۲۵٫۵، ۲۹٫۰.

مقادیر log10(مقدار نسبی) برابر با ۰، -۱، -۲، -۳ و -۴ هستند، زیرا هر مرحلهٔ رقت مقدار -log10(۱۰)، یا -۱، اضافه می‌کند. Ct در هر مرحله به‌اندازهٔ ۳٫۵ چرخه افزایش می‌یابد؛ بنابراین نقاط روی یک خط راست قرار می‌گیرند و رگرسیون خطی این نتایج را می‌دهد:

• شیب: -۳٫۵
• عرض از مبدأ: ۱۵٫۰
• R²: ۱٫۰

کارایی: E = ۱۰^(-۱/-۳٫۵) - ۱ = 10^0.286–۱ ≈ ۰٫۹۳۱، یا حدود ۹۳٪.

کارایی ۹۳٪ همراه با R² = ۱٫۰ معیارهای استاندارد کیفیت را برآورده می‌کند و برای کمّی‌سازی بیان ژن مناسب است.

نمونهٔ کد

این تابع JavaScript همان روش ماشین‌حساب را دنبال می‌کند. پیش از گرفتن لگاریتم، اندیس هر مقدار Ct منفی می‌شود، زیرا نخستین و غلیظ‌ترین نمونه بیشترین مقدار نسبی را دارد و هر نمونهٔ بعدی رقیق‌تر است.

1function qpcrEfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
2  // Sample 0 is most concentrated; each later sample is diluted further,
3  // so its log10(relative quantity) is negative.
4  const x = ctValues.map((_, i) => -i * Math.log10(dilutionFactor));
5  const n = ctValues.length;
6  let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0;
7  for (let i = 0; i < n; i++) {
8    sumX += x[i];
9    sumY += ctValues[i];
10    sumXY += x[i] * ctValues[i];
11    sumXX += x[i] * x[i];
12  }
13  const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
14  const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
15  const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
16  return { efficiency, slope, intercept };
17}
18
19qpcrEfficiency([15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0], 10);
20// => { efficiency: 93.07, slope: -3.5, intercept: 15 }
21

چرا کارایی برای بیان ژن اهمیت دارد؟

محاسبات تغییر چندبرابری، از جمله روش ΔΔCt، فرض می‌کنند هر واکنش هدف خود را در هر چرخه دو برابر می‌کند. وقتی یک ژن هدف و یک ژن مرجع کارایی‌های اندازه‌گیری‌شدهٔ متفاوتی داشته باشند، فرمول سادهٔ ΔΔCt خطا ایجاد می‌کند. پژوهشگران اغلب، هنگامی که کارایی‌ها بیش از حدود پنج واحد درصد تفاوت دارند، به محاسبه‌ای اصلاح‌شده بر اساس کارایی، مانند روش توصیف‌شده توسط Michael Pfaffl در ۲۰۰۱، روی می‌آورند. دستورالعمل‌های MIQE، که مجموعه‌ای پرارجاع از استانداردهای گزارش‌دهی qPCR منتشرشده در ۲۰۰۹ هستند، توصیه می‌کنند مطالعات کارایی محاسبه‌شده، شیب و R² را همراه با نتایج کمّی‌سازی گزارش کنند.

پرسش‌های متداول

درصد کارایی مناسب qPCR چقدر است؟

بازهٔ بین ۹۰٪ و ۱۱۰٪ معمولاً پذیرفته است و آزمون‌های بهینه‌سازی‌شده معمولاً به حدود ۹۵–۱۰۵% می‌رسند. شیب -۳٫۳۲ دقیقاً متناظر با ۱۰۰٪ است.

چرا کارایی qPCR من بیشتر از ۱۱۰٪ است؟

علت‌های رایج شامل خطاهای پیپت‌کردن در سری رقت، دایمرهای پرایمر، مهارکننده‌هایی که بر نمونه‌های غلیظ و رقیق به‌طور نابرابر اثر می‌گذارند، یا آستانهٔ فلورسانسی است که خارج از مرحلهٔ نمایی تکثیر تنظیم شده باشد. منحنی ذوب با بیش از یک قله می‌تواند به وجود دایمرهای پرایمر اشاره کند.

چرا کارایی qPCR من کمتر از ۹۰٪ است؟

علت‌های محتمل شامل طراحی نامناسب پرایمر، مهارکننده‌های PCR باقی‌مانده از استخراج نمونه یا دمای اتصال غیربهینه است. بررسی اختصاصیت پرایمر و اجرای گرادیان دما می‌تواند به یافتن علت کمک کند.

مقدار کم R² چه معنایی دارد؟

R² نشان می‌دهد مقادیر Ct تا چه حد در برابر مقدار لگاریتمی با یک خط راست برازش دارند. مقدار کمتر از ۰٫۹۸ بیانگر ناهماهنگی در پیپت‌کردن، مهارشدن نمونه یا نزدیک‌بودن یکی از نقاط رقت به حد تشخیص است.

منحنی استاندارد به چند نقطهٔ رقت نیاز دارد؟

حداقل سه نقطه، که برای رگرسیون خطی ضروری است. پنج یا شش نقطه شیب قابل‌اعتمادتری می‌دهند و شناسایی نقاط پرت را آسان‌تر می‌کنند.

آیا کارایی بین آزمایش‌ها تغییر می‌کند؟

بله. سری جدیدی از مواد، دستهٔ جدیدی از پرایمرها، نوع متفاوتی از نمونه یا دستگاه qPCR متفاوت می‌تواند کارایی را تغییر دهد. بسیاری از آزمایشگاه‌ها هر چند ماه یک‌بار یا با هر سری جدید مواد، کارایی را دوباره بررسی می‌کنند.

منابع

1. Bustin SA، Benes V، Garson JA و همکاران. دستورالعمل‌های MIQE: حداقل اطلاعات لازم برای انتشار آزمایش‌های PCR کمی بلادرنگ. Clinical Chemistry. ۲۰۰۹؛۵۵(۴):۶۱۱-۶۲۲.
2. Pfaffl MW. مدل ریاضی جدیدی برای کمّی‌سازی نسبی در RT-PCR بلادرنگ. Nucleic Acids Research. ۲۰۰۱؛۲۹(۹):e45.
3. Svec D، Tichopad A، Novosadova V، Pfaffl MW، Kubista M. برآورد کارایی PCR تا چه حد خوب است: توصیه‌هایی برای ارزیابی دقیق و قابل‌اعتماد کارایی qPCR. Biomolecular Detection and Quantification. ۲۰۱۵؛3:9-۱۶.