محاسبه‌گر غلظت DNA | مبدل A260 به ng/μL

محاسبه‌گر غلظت DNA

محاسبه‌گر غلظت DNA، خوانش جذب فرابنفش در ۲۶۰ نانومتر، موسوم به A260، را به غلظت DNA برحسب نانوگرم بر میکرولیتر (ng/µL) تبدیل می‌کند. همچنین مقدار کل DNA موجود در نمونه را برحسب میکروگرم (µg) گزارش می‌دهد.

جذب A260 چیست؟

A260 مقدار نور فرابنفشی است که یک محلول در طول موج ۲۶۰ نانومتر جذب می‌کند. DNA به‌دلیل بازهای نوکلئوتیدی خود، در نزدیکی این طول موج بیشترین جذب نور فرابنفش را دارد. اسپکتروفتومتر پس از انجام خوانش بلانک، با استفاده از همان بافری که برای نمونه به‌کار رفته است، A260 را اندازه‌گیری می‌کند تا جذب زمینه حذف شود. هرچه مقدار DNA در محلول بیشتر باشد، خوانش A260 بالاتر است.

فرمول غلظت DNA

DNA دو‌رشته‌ای، نور فرابنفش را متناسب با غلظت خود جذب می‌کند؛ این رابطه قانون بیر–لامبرت نام دارد. در مسیر نوری استاندارد ۱ سانتی‌متری، محلولی با خوانش A260 برابر با ۱٫۰، تقریباً حاوی ۵۰ ng/µL DNA دو‌رشته‌ای است. این مقدار که ضریب تبدیل نام دارد، هر خوانش A260 را به غلظت تبدیل می‌کند:

غلظت DNA (ng/µL) = A260 × ۵۰ × ضریب رقت

ضریب رقت هرگونه رقیق‌سازی انجام‌شده پیش از اندازه‌گیری نمونه را در نظر می‌گیرد. نمونه‌ای که بدون رقیق‌سازی اندازه‌گیری شده باشد، ضریب رقت ۱ دارد.

نحوه محاسبه بازده کل DNA

پس از مشخص شدن غلظت، جرم کل DNA موجود در نمونه را می‌توان از حجم آن به‌دست آورد:

DNA کل (µg) = غلظت (ng/µL) × حجم (µL) ÷ ۱۰۰۰

نحوه محاسبه غلظت DNA: مرحله‌به‌مرحله

1. پیش از اندازه‌گیری، نمونه را کاملاً مخلوط کنید. DNA ممکن است به دیواره‌های لوله بچسبد یا به‌طور نابرابر ته‌نشین شود.
2. اگر نمونه غلظت زیادی دارد، آن را رقیق کنید و هدف را خوانش A260 بین ۰٫۱ و ۱٫۰ قرار دهید. خوانش‌های اسپکتروفتومتر خارج از این محدوده کمترین قابلیت اعتماد را دارند.
3. اسپکتروفتومتر را با همان بافری که برای رقیق‌سازی استفاده شده است بلانک کنید، سپس نمونه را در ۲۶۰ نانومتر اندازه‌گیری کنید.
4. خوانش A260، حجم نمونه و ضریب رقت را در محاسبه‌گر وارد کنید تا غلظت و بازده کل به‌دست آید. برای نمایش نتیجه، هر سه کادر باید پر شده باشند و حجم باید بیشتر از صفر باشد.

مثال حل‌شده

مثال ۱: نمونه رقیق‌نشده

خوانش A260 برابر با ۰٫۵، بدون رقیق‌سازی (ضریب رقت ۱) و حجم نمونه برابر با ۱۰۰ µL است.

• غلظت = ۰٫۵ × ۵۰ × ۱ = ۲۵ ng/µL
• DNA کل = ۲۵ × ۱۰۰ ÷ ۱۰۰۰ = ۲٫۵ µg

مثال ۲: نمونه رقیق‌شده

یک لوله حاوی ۵۰ µL DNA خالص‌شده است. مقدار کمی از آن به نسبت ۱۰ برابر رقیق شد و بخش رقیق‌شده خوانش A260 برابر با ۰٫۷۵ نشان داد. ضریب رقت این خوانش را به غلظت موجود در لوله اصلی برمی‌گرداند و ۵۰ µL حجمی است که برای مرحله محاسبه بازده کل وارد می‌شود.

• غلظت = ۰٫۷۵ × ۵۰ × ۱۰ = ۳۷۵ ng/µL
• DNA کل = ۳۷۵ × ۵۰ ÷ ۱۰۰۰ = ۱۸٫۷۵ µg

محاسبه ضریب رقت

ضریب رقت = حجم کل پس از رقیق‌سازی ÷ حجم نمونه اولیه.

افزودن ۵ µL محلول DNA به ۴۵ µL بافر، حجم کل ۵۰ µL را ایجاد می‌کند؛ بنابراین ضریب رقت برابر است با ۵۰ ÷ ۵ = ۱۰. نمونه‌ای که رقیق نشده باشد، ضریب رقت ۱ دارد.

محدوده‌های معمول غلظت DNA

غلظت به نوع نمونه و روش استخراج بستگی دارد. غلظت حاصل از استخراج DNA ژنومی معمولاً حدوداً بین ۱۰ و ۱۰۰ ng/µL است. آماده‌سازی DNA پلاسمیدی اغلب غلظت‌های بالاتری ایجاد می‌کند و گاهی به چند صد ng/µL می‌رسد. نتیجه‌ای که برای یک روش مشخص بسیار خارج از محدوده مورد انتظار باشد، می‌تواند نشان‌دهنده وجود مشکل در استخراج یا خود اندازه‌گیری باشد.

محدودیت‌های اندازه‌گیری جذب فرابنفش

اندازه‌گیری A260 سریع است، اما حساس‌ترین یا اختصاصی‌ترین روش برای DNA نیست. پروتئین‌ها، RNA و برخی اجزای بافر نیز در نزدیکی ۲۶۰ نانومتر نور جذب می‌کنند و ممکن است خوانش را افزایش دهند. پژوهشگران اغلب نسبت A260/A280 را در کنار غلظت بررسی می‌کنند تا آلودگی پروتئینی را ارزیابی کنند؛ نسبتی نزدیک به ۱٫۸ معمولاً نشان‌دهنده نمونه DNA خالص است. روش‌های مبتنی بر رنگ فلورسنت، مانند آزمون‌های Qubit، فقط به DNA دو‌رشته‌ای متصل می‌شوند و برای نمونه‌های رقیق یا ناخالص خوانش دقیق‌تری ارائه می‌کنند، هرچند به معرف‌های اضافی و فلورومتر نیاز دارند.

پرسش‌های متداول

چگونه غلظت DNA را از A260 محاسبه می‌کنید؟

خوانش A260 را در ۵۰، یعنی ضریب تبدیل استاندارد برای DNA دو‌رشته‌ای، ضرب کنید و سپس حاصل را در ضریب رقت ضرب کنید. اگر نمونه رقیق نشده است، از ضریب رقت ۱ استفاده کنید.

نسبت مناسب A260/A280 چیست؟

نسبتی نزدیک به ۱٫۸ معمولاً نشان‌دهنده نمونه DNA خالص است. نسبت پایین‌تر نشان‌دهنده آلودگی پروتئینی است. نسبت بالاتر از ۲٫۰ ممکن است نشان‌دهنده آلودگی RNA باشد.

آیا می‌توان از این محاسبه‌گر برای RNA استفاده کرد؟

نه به‌طور مستقیم، زیرا RNA به‌جای ۵۰ از ضریب تبدیل ۴۰ ng/µL استفاده می‌کند. برای برآورد غلظت RNA، نتیجه محاسبه‌گر را در ۰٫۸ (۴۰ ÷ ۵۰) ضرب کنید، یا مستقیماً از A260 × ۴۰ × ضریب رقت استفاده کنید.

چرا خوانش A260 باید بین ۰٫۱ و ۱٫۰ باشد؟

جذب، مطابق قانون بیر–لامبرت، عمدتاً در همین محدوده تقریباً با غلظت متناسب می‌ماند. خارج از این محدوده، خوانش‌ها قابلیت اعتماد کمتری دارند؛ بنابراین نمونه‌ای که بیش از حد غلیظ یا رقیق است باید پیش از اندازه‌گیری دوباره، رقیق یا تغلیظ شود.

تفاوت میان غلظت یک ماده و میزان خلوص آن دقیقاً چیست؟

غلظت مقدار DNA موجود را برحسب ng/µL اندازه‌گیری می‌کند. خلوص نشان می‌دهد نمونه تا چه حد عاری از ناخالصی است و عمدتاً بر اساس نسبت‌های جذب مانند A260/A280 ارزیابی می‌شود. یک نمونه می‌تواند غلظت بالا و در عین حال ناخالص باشد، یا غلظت پایین و خلوص بسیار زیادی داشته باشد.

چگونه ng/µL را به µg/mL تبدیل کنم؟

این دو واحد از نظر عددی برابرند. ۱ ng/µL برابر با ۱ µg/mL است، زیرا واحد جرم و واحد حجم هر دو به اندازه ضریب ۱۰۰۰ تغییر مقیاس می‌دهند.

منابع

1. سامبروک، J. و راسل، D. W. (۲۰۰۱). کلون‌سازی مولکولی: راهنمای آزمایشگاه (ویرایش ۳). انتشارات آزمایشگاه کلد اسپرینگ هاربر.
2. گالاگر، S. R. و دژاردن، P. R. (۲۰۰۶). کمّی‌سازی DNA و RNA با طیف‌سنجی جذبی و فلورسانس. پروتکل‌های کنونی در زیست‌شناسی مولکولی، ۷۶(۱)، A-۳D.
3. منچستر، K. L. (۱۹۹۵). ارزش نسبت‌های A260/A280 برای اندازه‌گیری خلوص اسیدهای نوکلئیک. BioTechniques، ۱۹(۲)، ۲۰۸–۲۱۰.