محاسبه‌گر غلظت پروتئین | A280 به mg/mL

محاسبه‌گر غلظت پروتئین

محاسبه‌گر غلظت پروتئین، قرائت جذب نور از یک اسپکتروفتومتر را به مقدار پروتئین حل‌شده در محلول تبدیل می‌کند. نتیجه معمولاً برحسب میلی‌گرم بر میلی‌لیتر (mg/mL) یا میکروگرم بر میلی‌لیتر (μg/mL) ارائه می‌شود. این محاسبه بر پایه قانون بیر–لامبرت است؛ رابطه‌ای در شیمی که میزان جذب نور توسط نمونه را به مقدار ماده موجود در آن مرتبط می‌کند.

نحوه اندازه‌گیری غلظت پروتئین

بیشتر پروتئین‌ها نور فرابنفش را در طول موج ۲۸۰ نانومتر (nm) به‌شدت جذب می‌کنند. این جذب عمدتاً از دو اسید آمینه، تریپتوفان و تیروزین، ناشی می‌شود که در ساختار پروتئین وجود دارند. اسپکتروفتومتر نور را از میان نمونه عبور می‌دهد و مقدار جذب‌شده را اندازه‌گیری می‌کند. این قرائت «جذب» نام دارد و اگر در ۲۸۰ nm انجام شود، A280 نامیده می‌شود.

اندازه‌گیری جذب در ۲۸۰ nm سریع است و نمونه را از بین نمی‌برد. این ویژگی آن را از روش‌های شیمیایی مانند آزمون برادفورد یا BCA که در ادامه توضیح داده می‌شوند، متمایز می‌کند. این روش برای پروتئین خالص‌شده در محلول، با قرائت جذبی بین حدود ۰٫۱ و ۱٫۰، بهترین عملکرد را دارد. قرائت‌های خارج از این محدوده اطمینان کمتری دارند؛ بنابراین نمونه اغلب باید پیش از اندازه‌گیری رقیق شود.

فرمول غلظت پروتئین

ماشین‌حساب، قانون بیر–لامبرت را برای به‌دست‌آوردن غلظت بازآرایی می‌کند:

C = (A × DF) / (ε × l)

• C — غلظت پروتئین، برحسب mg/mL
• A — جذب در ۲۸۰ nm (عددی بدون واحد)
• DF — ضریب رقت؛ تعداد دفعاتی که نمونه اولیه پیش از اندازه‌گیری رقیق شده است
• ε — ضریب خاموشی، ثابت ویژهٔ پروتئین، بر حسب L/(g·cm)
• l — طول مسیر، فاصله‌ای که نور در نمونه طی می‌کند، برحسب cm (معمولاً ۱ cm در کووت استاندارد؛ ظرف کوچک شیشه‌ای یا پلاستیکی مورد استفاده در اسپکتروفتومتر)

برای تبدیل نتیجه به میکروگرم بر میلی‌لیتر، مقدار mg/mL را در ۱٬۰۰۰ ضرب کنید. برای یافتن جرم کل پروتئین در نمونه، غلظت را در حجم نمونه برحسب میلی‌لیتر ضرب کنید.

مثال حل‌شده

نمونه‌ای جذب نوری برابر با ۰٫۵ در ۲۸۰ نانومتر نشان می‌دهد. نمونه رقیق نشده است؛ بنابراین ضریب رقت ۱ است و اندازه‌گیری در کووت استاندارد ۱ cm انجام شده است. پروتئین، آلبومین سرم گاوی (BSA)، دارای ضریب خاموشی ۰٫۶۶۷ L/(g·cm) است.

C = (۰٫۵ × ۱) / (۰٫۶۶۷ × ۱) ≈ ۰٫۷۵ mg/mL

در نمونه‌ای با حجم ۱ mL، این مقدار تقریباً ۰٫۷۵ mg پروتئین کل، یا ۷۵۰ μg/mL است.

ضرایب خاموشی پروتئین‌های رایج

هر پروتئین نور را به شکل متفاوتی جذب می‌کند، زیرا تعداد باقی‌مانده‌های تریپتوفان و تیروزین در آن‌ها متفاوت است. ضریب خاموشی، میزان جذب نور را برای پروتئینی مشخص در ۲۸۰ نانومتر و با واحد L/(g·cm) توصیف می‌کند. مقادیر رایج عبارت‌اند از:

ماشین‌حساب می‌تواند ضریب خاموشی سفارشیِ پروتئینی را نیز بپذیرد که در این فهرست نیامده است. برای پروتئینی با توالی اسید آمینه شناخته‌شده، این مقدار را می‌توان با فرمولی که جیل و فون هیپل در سال ۱۹۸۹ منتشر کردند، برآورد کرد: ε₂₈₀ = (باقی‌مانده‌های تریپتوفان × ۵٬۵۰۰) + (باقی‌مانده‌های تیروزین × ۱٬۴۹۰) + (باقی‌مانده‌های سیستین × ۱۲۵). این فرمول نتیجه را برحسب M⁻¹cm⁻¹، یعنی یک واحد مولار، ارائه می‌کند که با مقادیر جرمی L/(g·cm) بالا متفاوت است. ابزارهای رایگانی مانند ProtParam که روی سرور ExPASy میزبانی می‌شوند، این مقدار را مستقیماً بر اساس توالی پروتئین محاسبه می‌کنند.

طول مسیر و ضریب رقت

طول مسیر، عرض کووت نگهدارنده نمونه است که برحسب سانتی‌متر اندازه‌گیری می‌شود. عرض کووت‌های استاندارد ۱ cm است. اسپکتروفتومترهای میکروحجمی که نمونه‌های بسیار کوچک را اندازه‌گیری می‌کنند، ممکن است از مسیر بسیار کوتاه‌تری، مانند ۰٫۱ cm، استفاده کنند.

ضریب رقت، هرگونه رقیق‌سازی انجام‌شده پیش از اندازه‌گیری را در نظر می‌گیرد. اگر نمونه غلیظ قرائت جذبی بیشتر از ۱٫۰ ایجاد کند، معمولاً ابتدا آن را با بافر رقیق می‌کنند. ضریب رقت برابر است با حجم کل رقیق‌شده تقسیم بر حجم نمونه اولیه. برای مثال، مخلوط‌کردن ۱۰ μL نمونه با ۹۹۰ μL بافر، حجم کل ۱٬۰۰۰ μL و ضریب رقت ۱۰۰ ایجاد می‌کند.

روش‌های دیگر اندازه‌گیری غلظت پروتئین

جذب در ۲۸۰ nm یکی از چندین روش رایج مورد استفاده در آزمایشگاه است.

• آزمون برادفورد: از رنگی استفاده می‌کند که هنگام اتصال به پروتئین تغییر رنگ می‌دهد. این روش برای نمونه‌های خالص‌نشده عملکرد خوبی دارد، اما تغییر رنگ می‌تواند بین پروتئین‌های مختلف متفاوت باشد.
• آزمون BCA: به تغییر رنگ ناشی از پیوندهای پپتیدی پروتئین متکی است. این روش با بسیاری از شوینده‌ها سازگار است، اما اجرای آن از قرائت مستقیم جذب زمان بیشتری می‌برد.
• روش لوری: روشی قدیمی‌تر است که حساسیت بسیار بالایی دارد، اما با برخی مواد رایج تشکیل‌دهنده بافر واکنش نامطلوبی نشان می‌دهد.

هر سه روش نمونه را از بین می‌برند. اندازه‌گیری مستقیم A280 چنین نیست؛ بنابراین می‌توان همان نمونه را بازیابی و دوباره استفاده کرد.

پرسش‌های متداول

محدوده جذب ایدئال برای این روش چیست؟

بین ۰٫۱ و ۱٫۰. کمتر از ۰٫۱، قرائت دقیق نیست. بیشتر از ۱٫۰، رابطه بین جذب و غلظت ممکن است دیگر خطی نباشد؛ بنابراین نمونه باید ابتدا رقیق شود.

چرا به‌جای ۲۸۰ nm در ۲۶۰ nm اندازه‌گیری می‌شود؟

اسیدهای نوکلئیک، مانند DNA و RNA، در ۲۶۰ nm به‌شدت جذب می‌کنند. پروتئین‌ها به دلیل داشتن تریپتوفان و تیروزین، در ۲۸۰ nm جذب بیشتری دارند. اندازه‌گیری در ۲۸۰ nm تداخل ناشی از هرگونه اسید نوکلئیک موجود در نمونه را کاهش می‌دهد.

ضریب خاموشی پروتئینی که در فهرست نیست چگونه پیدا می‌شود؟

برای پروتئینی با توالی شناخته‌شده، ابزاری مانند ProtParam ضریب خاموشی را بر اساس تعداد باقی‌مانده‌های تریپتوفان، تیروزین و سیستین محاسبه می‌کند. این ضریب را می‌توان مستقیماً نیز اندازه‌گیری کرد؛ با مقایسه جذب نمونه با محلولی با غلظت معلوم.

آیا این روش برای مخلوطی از پروتئین‌ها کار می‌کند؟

این روش برای یک پروتئین منفرد و خالص با ضریب خاموشی معلوم بهترین عملکرد را دارد. مخلوطی از پروتئین‌های ناشناخته، مانند لیزات سلولی، معمولاً با آزمون برادفورد یا BCA اندازه‌گیری می‌شود، زیرا این روش‌ها برآورد سازگارتری از مقدار کل پروتئین ارائه می‌کنند.

آیا شوینده‌ها می‌توانند در قرائت اختلال ایجاد کنند؟

بله. بسیاری از شوینده‌ها در نزدیکی ۲۸۰ nm نور را جذب می‌کنند و می‌توانند نتیجه را مخدوش کنند. استفاده از نمونه شاهدی که همان غلظت شوینده را دارد، به حذف این جذب زمینه‌ای کمک می‌کند. غلظت‌های بسیار بالای شوینده ممکن است استفاده از آزمونی سازگار با شوینده، مانند BCA، را لازم کند.