DNA-annealing-lämpötilan laskin

Johdanto DNA-annealing-lämpötilaan

DNA-annealing-lämpötilan laskin on olennainen työkalu molekyylibiologeille, genetiikoille ja tutkijoille, jotka työskentelevät polymeraasiketjureaktiossa (PCR). Annealing-lämpötila viittaa optimaaliseen lämpötilaan, jossa DNA-primerit sitoutuvat täydentäviin sekvensseihinsä PCR:n aikana. Tämä kriittinen parametri vaikuttaa merkittävästi PCR-reaktioiden spesifisyyteen ja tehokkuuteen, joten tarkan laskennan tekeminen on elintärkeää onnistuneiden kokeiden kannalta.

DNA-annealing-lämpötilan laskimemme tarjoaa yksinkertaisen mutta tehokkaan tavan määrittää optimaalinen annealing-lämpötila DNA-primeillesi niiden sekvenssin ominaisuuksien perusteella. Analysoimalla tekijöitä, kuten GC-pitoisuus, sekvenssin pituus ja nukleotidikoostumus, tämä laskin antaa tarkkoja lämpötilasuosituksia PCR-protokolliesi optimointiin.

Olitpa sitten suunnittelemassa primeja geenin amplifioimiseen, mutaatioiden havaitsemiseen tai DNA-sekvensointiin, annealing-lämpötilan ymmärtäminen ja oikean asettaminen on ratkaisevan tärkeää kokeiden onnistumiselle. Tämä laskin poistaa arvailut ja auttaa sinua saavuttamaan johdonmukaisempia ja luotettavampia PCR-tuloksia.

Tiede annealing-lämpötilan takana

Ymmärtäminen DNA-primerin annealingista

DNA-annealing on prosessi, jossa yksijuosteiset DNA-primerit sitoutuvat täydentäviin sekvensseihinsä mallidna:ssa. Tämä hybridisaatiovaihe tapahtuu jokaisen PCR-syklin toisessa vaiheessa, denaturoinnin (juosteiden erottaminen) ja pidentämisen (DNA-synteesi) vaiheiden välillä.

Annealing-lämpötila vaikuttaa suoraan:

Spesifisyyteen: Liian alhaiset lämpötilat sallivat ei-spesifisen sitoutumisen, mikä johtaa ei-toivottuihin tuotteisiin
Tehokkuuteen: Liian korkeat lämpötilat estävät oikean primerin sitoutumisen, vähentäen saantoa
Toistettavuuteen: Johdonmukaiset annealing-lämpötilat varmistavat luotettavat tulokset kokeiden välillä

Optimaalinen annealing-lämpötila riippuu ensisijaisesti primerin nukleotidikoostumuksesta, erityisesti guaniinin (G) ja sytosiinin (C) suhteesta, jota kutsutaan GC-pitoisuudeksi.

DNA-juosteet erottuvat Primerit sitoutuvat malliin DNA-polymeraasi pidentää

Primeri

GC-pitoisuuden rooli

GC-pohjaiset parit muodostavat kolme vetysidosta, kun taas adeniini (A) ja tymiini (T) parit muodostavat vain kaksi. Tämä ero tekee GC-rikkaista sekvensseistä lämpötilaltaan vakaampia, mikä vaatii korkeampia lämpötiloja denaturoimiseen ja annealingiin. Tärkeitä seikkoja GC-pitoisuudesta:

Korkeampi GC-pitoisuus = vahvempi sitoutuminen = korkeampi annealing-lämpötila
Alhaisempi GC-pitoisuus = heikompi sitoutuminen = matalampi annealing-lämpötila
Useimmilla primeilla on GC-pitoisuus 40-60% optimaalisen suorituskyvyn saavuttamiseksi
Äärimmäinen GC-pitoisuus (alle 30% tai yli 70%) voi vaatia erityisiä PCR-olosuhteita

Primerin pituuden huomioon ottaminen

Primerin pituus vaikuttaa myös merkittävästi annealing-lämpötilaan:

Lyhyemmät primerit (15-20 nukleotidia) vaativat yleensä alhaisempia annealing-lämpötiloja
Pidemmät primerit (25-35 nukleotidia) tarvitsevat tyypillisesti korkeampia annealing-lämpötiloja
Useimmat standardi PCR-primerit vaihtelevat pituudeltaan 18-30 nukleotidia
Erittäin lyhyet primerit (<15 nukleotidia) saattavat puuttua spesifisyydestä riippumatta annealing-lämpötilasta

Annealing-lämpötilan laskentakaava

Laskimemme käyttää laajalti hyväksyttyä kaavaa DNA-primerien annealing-lämpötilan (Tm) arvioimiseksi:

$Tm = 64.9 + 41 \times \frac{(GC\% - 16.4)}{N}$

Missä:

Tm = Annealing-lämpötila celsiusasteina (°C)
GC% = G- ja C-nukleotidien prosenttiosuus primerin sekvenssissä
N = Primerin sekvenssin kokonaispituus (nukleotidien määrä)

Tämä kaava, joka perustuu lähinnä naapuri-thermodynaamiseen malliin, tarjoaa luotettavan arvion 18-30 nukleotidin pituisille primeille, joilla on standardi GC-pitoisuus (40-60%).

Esimerkkilaskenta

Primerille, jonka sekvenssi on ATGCTAGCTAGCTGCTAGC:

Pituus (N) = 19 nukleotidia
GC-luku = 9 (G- tai C-nukleotidia)
GC% = (9/19) × 100 = 47.4%
Tm = 64.9 + 41 × (47.4 - 16.4) / 19
Tm = 64.9 + 41 × 31 / 19
Tm = 64.9 + 41 × 1.63
Tm = 64.9 + 66.83
Tm = 66.83°C

Kuitenkin käytännön PCR-sovelluksissa käytetty todellinen annealing-lämpötila on tyypillisesti 5-10°C alle lasketun Tm:n, jotta varmistetaan tehokas primerin sitoutuminen. Esimerkissämme, jossa lasketun Tm:n arvo on 66.83°C, suositeltu annealing-lämpötila PCR:lle olisi noin 56.8-61.8°C.

Kuinka käyttää DNA-annealing-lämpötilan laskinta

DNA-annealing-lämpötilan laskimen käyttäminen on suoraviivaista:

Syötä DNA-primerisi sekvenssi syöttökenttään (vain A, T, G ja C -merkkejä sallitaan)
Laskin automaattisesti validoi sekvenssisi varmistaakseen, että se sisältää vain kelvollisia DNA-nukleotideja
Kun kelvollinen sekvenssi on syötetty, laskin näyttää heti:
- Sekvenssin pituus
- GC-pitoisuusprosentti
- Laskettu annealing-lämpötila
Voit kopioida tulokset käyttämällä kopio-nappia helppoa viittausta varten
Uuden laskennan suorittamiseksi syötä yksinkertaisesti toinen primer-sekvenssi

Laskin antaa reaaliaikaista palautetta, jolloin voit nopeasti testata erilaisia primer-suunnitelmia ja verrata niiden annealing-lämpötiloja.

Vinkkejä optimaalisten tulosten saavuttamiseksi

Syötä täydellinen primer-sekvenssi ilman välilyöntejä tai erikoismerkkejä
Primeriparien kohdalla laske jokainen primer erikseen ja käytä matalampaa lämpötilaa
Harkitse laskettua lämpötilaa lähtökohtana, ja optimoi kokeellisten testien avulla
Degeneroitujen primerien kohdalla laske käyttäen mahdollisimman GC-rikkaan yhdistelmän

Käytännön sovellukset

PCR-optimointi

Annealing-lämpötilan laskennan ensisijainen sovellus on PCR-optimointi. Oikean annealing-lämpötilan valinta auttaa:

Lisäämään amplifioinnin spesifisyyttä
Vähentämään primer-dimerien muodostumista
Miniminoimaan ei-spesifistä amplifikaatiota
Parantamaan halutun tuotteen saantoa
Lisäämään toistettavuutta kokeiden välillä

Monet PCR-epäonnistumiset voidaan jäljittää sopimattomiin annealing-lämpötiloihin, mikä tekee tästä laskennasta olennaisen vaiheen kokeellisen suunnittelun kannalta.

Primerin suunnittelu

Kun suunnittelet primeja, annealing-lämpötila on kriittinen huomioon otettava seikka:

Pyri suunnittelemaan primeripareja, joilla on samanlaiset annealing-lämpötilat (5°C sisällä toisistaan)
Suunnittele primeja, joilla on kohtuullinen GC-pitoisuus (40-60%) ennakoitavan annealing-käyttäytymisen saavuttamiseksi
Vältä äärimmäistä GC-pitoisuutta primerien 3' päässä
Harkitse GC-lisäyksien (G- tai C-nukleotideja) lisäämistä 3' päähän sitoutumisen vakauden parantamiseksi

Erityiset PCR-tekniikat

Eri PCR-muunnokset saattavat vaatia erityisiä lähestymistapoja annealing-lämpötilaan:

PCR-tekniikka	Annealing-lämpötilan huomioon ottaminen
Touchdown PCR	Aloita korkeasta lämpötilasta ja vähennä asteittain
Nested PCR	Sisäisillä ja ulkoisilla primeilla voi olla erilaiset lämpötilat
Multiplex PCR	Kaikkien primerien tulisi olla samanlaisissa annealing-lämpötiloissa
Hot-start PCR	Korkeampi alkuperäinen annealing-lämpötila ei-spesifisen sitoutumisen vähentämiseksi
Reaalimaailman PCR	Tarkka lämpötilan hallinta johdonmukaisen kvantifioinnin saavuttamiseksi

Vaihtoehtoiset laskentamenetelmät

Vaikka laskimemme käyttää laajalti hyväksyttyä kaavaa, useita vaihtoehtoisia menetelmiä on olemassa annealing-lämpötilan laskemiseen:

Peruskaava: Tm = 2(A+T) + 4(G+C)
- Yksinkertainen mutta vähemmän tarkka pidemmille primeille
- Sopii nopeisiin arvioihin lyhyillä primeilla
Wallace-sääntö: Tm = 64.9 + 41 × (GC% - 16.4) / N
- Kaava, jota käytetään laskimessamme
- Hyvä tasapaino yksinkertaisuuden ja tarkkuuden välillä
Lähin-naapuri-menetelmä: Käyttää termodynaamisia parametreja
- Tarkin ennustemenetelmä
- Ottaen huomioon sekvenssikonteksti, ei vain koostumusta
- Vaatii monimutkaisia laskelmia tai erikoistunutta ohjelmistoa
Suolaa säätelevä kaava: Sisältää suolapitoisuuden vaikutukset
- Tm = 81.5 + 16.6 × log10[Na+] + 0.41 × (GC%) - 600/N
- Hyödyllinen ei-standardin puskurin olosuhteissa

Jokaisella menetelmällä on omat vahvuutensa ja rajoituksensa, mutta Wallace-sääntö tarjoaa hyvän tasapainon tarkkuuden ja yksinkertaisuuden välillä useimmissa standardi PCR-sovelluksissa.

Annealing-lämpötilaan vaikuttavat tekijät

Puskurikoostumus

PCR-puskurin ionivahvuus vaikuttaa merkittävästi annealing-lämpötilaan:

Korkeammat suolapitoisuudet vakauttavat DNA-dupleksit, mikä käytännössä nostaa annealing-lämpötilaa
Magnesiumin pitoisuus vaikuttaa erityisesti primerin sitoutumiseen
GC-rikkaille malleille tarkoitetut erikoispuskurit voivat muuttaa optimaalista annealing-lämpötilaa

DNA-mallin monimutkaisuus

Mallidna:n luonne voi vaikuttaa annealing-käyttäytymiseen:

Genominen DNA voi vaatia korkeampaa tiukkuutta (korkeampi annealing-lämpötila)
Plasmidi- tai puhdistetut mallit toimivat usein hyvin standardilla lasketulla lämpötilalla
GC-rikkaat alueet saattavat tarvita korkeampia denaturointilämpötiloja mutta matalampia annealing-lämpötiloja

PCR-lisäaineet

Erilaiset lisäaineet voivat muuttaa annealing-käyttäytymistä:

DMSO ja betaiini auttavat vähentämään toissijaisia rakenteita, mikä voi laskea tehokasta annealing-lämpötilaa
Formamiidi vähentää sulamislämpötilaa
BSA ja muut stabiloivat aineet saattavat vaatia lämpötilan säätöä

Historiallinen konteksti

PCR:n ja annealing-lämpötilan ymmärtämisen kehitys

DNA-annealing-lämpötilan käsite tuli kriittiseksi PCR:n kehittämisen myötä, jonka Kary Mullis esitteli vuonna 1983. Varhaiset PCR-protokollat käyttivät empiirisiä lähestymistapoja annealing-lämpötilojen määrittämiseen, usein kokeilemalla ja erehtymällä.

Keskeiset virstanpylväät annealing-lämpötilan laskennassa:

1960-luku: Perustietämyksen DNA-hybridisaatiokinetiikasta perustaminen
1970-luku: Yksinkertaisten kaavojen kehittäminen GC-pitoisuuden perusteella
1980-luku: PCR:n käyttöönotto ja annealing-lämpötilan merkityksen tunnustaminen
1990-luku: Lähin-naapuri-termodynaamisten mallien kehittäminen
2000-luku: Tarkkojen annealing-lämpötilan ennustamiseen tarkoitettujen laskentatyökalujen kehittäminen
Nykyhetki: Koneoppimislähestymistapojen integrointi monimutkaisten mallien ennustamiseen

Annealing-lämpötilan ennustamisen tarkkuus on parantunut dramaattisesti ajan myötä, mikä on myötävaikuttanut PCR-pohjaisten tekniikoiden laajaan hyväksyntään ja menestykseen molekyylibiologiassa.

Koodiesimerkit annealing-lämpötilan laskemiseen

Python-toteutus

1def calculate_gc_content(sequence):
2    """Laske DNA-sekvenssin GC-pitoisuusprosentti."""
3    sequence = sequence.upper()
4    gc_count = sequence.count('G') + sequence.count('C')
5    return (gc_count / len(sequence)) * 100 if len(sequence) > 0 else 0
6
7def calculate_annealing_temperature(sequence):
8    """Laske annealing-lämpötila Wallace-säännön avulla."""
9    sequence = sequence.upper()
10    if not sequence or not all(base in 'ATGC' for base in sequence):
11        return 0
12        
13    gc_content = calculate_gc_content(sequence)
14    length = len(sequence)
15    
16    # Wallace-säännön kaava
17    tm = 64.9 + 41 * (gc_content - 16.4) / length
18    
19    return round(tm * 10) / 10  # Pyöristä 1 desimaaliin
20
21# Esimerkkikäyttö
22primer_sequence = "ATGCTAGCTAGCTGCTAGC"
23gc_content = calculate_gc_content(primer_sequence)
24tm = calculate_annealing_temperature(primer_sequence)
25
26print(f"Seqvenssi: {primer_sequence}")
27print(f"Pituus: {len(primer_sequence)}")
28print(f"GC-pitoisuus: {gc_content:.1f}%")
29print(f"Annealing-lämpötila: {tm:.1f}°C")
30

JavaScript-toteutus

1function calculateGCContent(sequence) {
2  if (!sequence) return 0;
3  
4  const upperSequence = sequence.toUpperCase();
5  const gcCount = (upperSequence.match(/[GC]/g) || []).length;
6  return (gcCount / upperSequence.length) * 100;
7}
8
9function calculateAnnealingTemperature(sequence) {
10  if (!sequence) return 0;
11  
12  const upperSequence = sequence.toUpperCase();
13  // Varmista DNA-sekvenssi (vain A, T, G, C sallitaan)
14  if (!/^[ATGC]+$/.test(upperSequence)) return 0;
15  
16  const length = upperSequence.length;
17  const gcContent = calculateGCContent(upperSequence);
18  
19  // Wallace-säännön kaava
20  const annealingTemp = 64.9 + (41 * (gcContent - 16.4)) / length;
21  
22  // Pyöristä 1 desimaaliin
23  return Math.round(annealingTemp * 10) / 10;
24}
25
26// Esimerkkikäyttö
27const primerSequence = "ATGCTAGCTAGCTGCTAGC";
28const gcContent = calculateGCContent(primerSequence);
29const tm = calculateAnnealingTemperature(primerSequence);
30
31console.log(`Sekvenssi: ${primerSequence}`);
32console.log(`Pituus: ${primerSequence.length}`);
33console.log(`GC-pitoisuus: ${gcContent.toFixed(1)}%`);
34console.log(`Annealing-lämpötila: ${tm.toFixed(1)}°C`);
35

R-toteutus

1calculate_gc_content <- function(sequence) {
2  if (nchar(sequence) == 0) return(0)
3  
4  sequence <- toupper(sequence)
5  gc_count <- sum(strsplit(sequence, "")[[1]] %in% c("G", "C"))
6  return((gc_count / nchar(sequence)) * 100)
7}
8
9calculate_annealing_temperature <- function(sequence) {
10  if (nchar(sequence) == 0) return(0)
11  
12  sequence <- toupper(sequence)
13  # Varmista DNA-sekvenssi
14  if (!all(strsplit(sequence, "")[[1]] %in% c("A", "T", "G", "C"))) return(0)
15  
16  gc_content <- calculate_gc_content(sequence)
17  length <- nchar(sequence)
18  
19  # Wallace-säännön kaava
20  tm <- 64.9 + 41 * (gc_content - 16.4) / length
21  
22  return(round(tm, 1))
23}
24
25# Esimerkkikäyttö
26primer_sequence <- "ATGCTAGCTAGCTGCTAGC"
27gc_content <- calculate_gc_content(primer_sequence)
28tm <- calculate_annealing_temperature(primer_sequence)
29
30cat(sprintf("Sekvenssi: %s\n", primer_sequence))
31cat(sprintf("Pituus: %d\n", nchar(primer_sequence)))
32cat(sprintf("GC-pitoisuus: %.1f%%\n", gc_content))
33cat(sprintf("Annealing-lämpötila: %.1f°C\n", tm))
34

Excel-kaava

1' Laske GC-pitoisuus solussa A1
2=SUM(LEN(A1)-LEN(SUBSTITUTE(UPPER(A1),"G",""))-LEN(SUBSTITUTE(UPPER(A1),"C","")))/LEN(A1)*100
3
4' Laske annealing-lämpötila Wallace-säännön avulla
5=64.9+41*((SUM(LEN(A1)-LEN(SUBSTITUTE(UPPER(A1),"G",""))-LEN(SUBSTITUTE(UPPER(A1),"C","")))/LEN(A1)*100)-16.4)/LEN(A1)
6

Usein kysytyt kysymykset (UKK)

Mikä on DNA-annealing-lämpötila?

DNA-annealing-lämpötila on optimaalinen lämpötila, jolla DNA-primerit sitoutuvat erityisesti täydentäviin sekvensseihinsä PCR:n aikana. Se on kriittinen parametri, joka vaikuttaa PCR-reaktioiden spesifisyyteen ja tehokkuuteen. Ihanteellinen annealing-lämpötila sallii primerien sitoutua vain niiden tarkoille kohdesekvensseille, minimoiden ei-spesifisen amplifikaation.

Miten GC-pitoisuus vaikuttaa annealing-lämpötilaan?

GC-pitoisuus vaikuttaa merkittävästi annealing-lämpötilaan, koska G-C-pohjaiset parit muodostavat kolme vetysidosta, kun taas A-T-pohjaiset parit muodostavat vain kaksi. Korkeampi GC-pitoisuus johtaa vahvempaan sitoutumiseen ja vaatii korkeampia annealing-lämpötiloja. Jokainen 1%:n nousu GC-pitoisuudessa nostaa sulamislämpötilaa noin 0.4°C, mikä puolestaan vaikuttaa optimaaliseen annealing-lämpötilaan.

Mitä tapahtuu, jos käytän väärää annealing-lämpötilaa?

Väärän annealing-lämpötilan käyttäminen voi johtaa useisiin PCR-ongelmiin:

Liian alhainen: Ei-spesifinen sitoutuminen, useita kaistoja, primer-dimerit ja taustaa amplifikaatio
Liian korkea: Huono tai ei amplifikaatiota tehokkaan primerin sitoutumisen estämiseksi
Optimaalinen: Puhtaan, spesifisen amplifikaation saavuttaminen kohdesekvenssistä

Tulisko minun käyttää tarkkaa laskettua annealing-lämpötilaa?

Laskettu annealing-lämpötila toimii lähtökohtana. Käytännössä optimaalinen annealing-lämpötila on tyypillisesti 5-10°C laskettua sulamislämpötilaa (Tm) alempi. Haastavissa malleissa tai primeissa on usein hyödyllistä suorittaa lämpötilagradientti PCR kokeellisesti parhaan annealing-lämpötilan määrittämiseksi.

Miten lasken annealing-lämpötilan primeripareille?

Primeriparien kohdalla laske Tm jokaiselle primerille erikseen. Yleisesti ottaen käytä annealing-lämpötilaa, joka perustuu matalampaan Tm:ään, jotta molemmat primerit sitoutuvat tehokkaasti. Ihanteellisesti suunnittele primeripareja, joilla on samanlaiset Tm-arvot (5°C sisällä toisistaan) optimaalisen PCR-suorituskyvyn saavuttamiseksi.

Voinko käyttää tätä laskinta degeneroitujen primerien kanssa?

Tämä laskin on suunniteltu standardeille DNA-primeille, jotka sisältävät vain A, T, G ja C -nukleotideja. Degeneroitujen primerien, jotka sisältävät epäselviä perusteita (kuten R, Y, N), kohdalla laskin ei ehkä anna tarkkoja tuloksia. Tällaisissa tapauksissa harkitse Tm:n laskemista mahdollisimman GC-rikkaan ja AT-rikkaan yhdistelmän avulla lämpötila-alueen määrittämiseksi.

Miten primerin pituus vaikuttaa annealing-lämpötilaan?

Primerin pituus vaikuttaa käänteisesti GC-pitoisuuden vaikutukseen annealing-lämpötilaan. Pidemmissä primeissa GC-pitoisuuden vaikutus laimenee useampien nukleotidien kesken. Yleisesti ottaen pidemmät primerit tarjoavat vakaamman sitoutumisen ja voivat sietää korkeampia annealing-lämpötiloja. Kaava ottaa tämän huomioon jakamalla GC-pitoisuuskerroin primerin pituudella. Yleisesti ottaen pidemmät primerit ovat vakaampia ja vaativat korkeampia annealing-lämpötiloja.

Miksi erilaiset laskimet antavat erilaisia annealing-lämpötiloja?

Eri annealing-lämpötilan laskimet käyttävät erilaisia kaavoja ja algoritmeja, mukaan lukien:

Perus-GC-pitoisuuskaavat
Wallace-sääntö (käytetään tässä laskimessa)
Lähin-naapuri-termodynaamiset mallit
Suolaa säätelevät laskelmat

Nämä erilaiset lähestymistavat voivat johtaa lämpötilan vaihteluihin 5-10°C saman primerisekvenssin kohdalla. Wallace-sääntö tarjoaa hyvän tasapainon yksinkertaisuuden ja tarkkuuden välillä useimmissa standardi PCR-sovelluksissa.

Miten PCR-lisäaineet vaikuttavat annealing-lämpötilaan?

Yleiset PCR-lisäaineet voivat merkittävästi muuttaa tehokasta annealing-lämpötilaa:

DMSO: Tyypillisesti alentaa Tm:ää 5.5-6.0°C per 10% DMSO
Betaine: Vähentää Tm:ää tasoittamalla GC- ja AT-pohjaisten parien vaikutusta
Formamiidi: Vähentää Tm:ää noin 2.4-2.9°C per 10% formamiidi
Glyseroli: Voi joko nostaa tai laskea Tm:ää riippuen pitoisuudesta

Kun käytät näitä lisäaineita, saatat joutua säätämään annealing-lämpötilaa vastaavasti.

Voinko käyttää tätä laskinta qPCR:lle/reaalimaailman PCR:lle?

Kyllä, tätä laskinta voidaan käyttää qPCR-primerin suunnitteluun. Kuitenkin reaalimaailman PCR:ssä käytetään usein lyhyempiä ampliconeja ja saatetaan tarvita tiukempia primerisuunnittelukriteerejä. Optimaalisten qPCR-tulosten saavuttamiseksi harkitse lisätekijöitä, kuten amplicon pituus (ihanteellisesti 70-150 bp) ja toissijaisten rakenteiden muodostuminen.

Viitteet

Rychlik W, Spencer WJ, Rhoads RE. Optimointi DNA:n amplifiointilämpötilalle in vitro. Nucleic Acids Res. 1990;18(21):6409-6412. doi:10.1093/nar/18.21.6409
SantaLucia J Jr. Yhdistetty näkemys polymerin, hölkkäjuosteen ja oligodeoksiribonukleotidin lähimmän naapurin termodynaamisesta käyttäytymisestä. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95(4):1460-1465. doi:10.1073/pnas.95.4.1460
Lorenz TC. Polymeraasiketjureaktio: perusprotokolla sekä ongelmanratkaisu- ja optimointistrategiat. J Vis Exp. 2012;(63):e3998. doi:10.3791/3998
Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ, eds. PCR-protokollat: Opas menetelmiin ja sovelluksiin. Academic Press; 1990.
Mullis KB. Polymeraasiketjureaktion epätavallinen alku. Sci Am. 1990;262(4):56-65. doi:10.1038/scientificamerican0490-56
Wallace RB, Shaffer J, Murphy RF, Bonner J, Hirose T, Itakura K. Synteettisten oligodeoksiribonukleotidien hybridisaatio phi chi 174 DNA:han: yhden perusteen virheellisten vaikutusten tutkiminen. Nucleic Acids Res. 1979;6(11):3543-3557. doi:10.1093/nar/6.11.3543
Owczarzy R, Moreira BG, You Y, Behlke MA, Walder JA. DNA-dupleksien vakauden ennustaminen magnesium- ja monovalenttisten kationien sisältävissä liuoksissa. Biochemistry. 2008;47(19):5336-5353. doi:10.1021/bi702363u
Dieffenbach CW, Lowe TM, Dveksler GS. Yleiset käsitteet PCR-primerin suunnittelussa. PCR Methods Appl. 1993;3(3):S30-S37. doi:10.1101/gr.3.3.s30

Yhteenveto

DNA-annealing-lämpötilan laskin tarjoaa arvokkaan työkalun molekyylibiologeille ja tutkijoille, jotka työskentelevät PCR:n parissa. Määrittämällä tarkasti optimaalisen annealing-lämpötilan DNA-primeille voit merkittävästi parantaa PCR-kokeiden spesifisyyttä, tehokkuutta ja toistettavuutta.

Muista, että vaikka laskin tarjoaa tieteellisesti perustellun lähtökohdan, PCR-optimointi vaatii usein kokeellista testausta. Harkitse laskettua annealing-lämpötilaa oppaana ja ole valmis säätämään kokeellisten tulosten perusteella.

Monimutkaisille malleille, haastaville amplifikaatioille tai erityisille PCR-sovelluksille saatat joutua suorittamaan lämpötilagradientti PCR:n tai tutkimaan vaihtoehtoisia laskentamenetelmiä. Kuitenkin useimmissa standardi PCR-sovelluksissa tämä laskin tarjoaa luotettavan perustan onnistuneille kokeille.

Kokeile DNA-annealing-lämpötilan laskinta tänään parantaaksesi PCR-protokolliasi ja saavuttaaksesi johdonmukaisempia, spesifisiä amplifikaatiotuloksia molekyylibiologisessa tutkimuksessasi.

DNA:n liitoslämpötilan laskuri PCR-primerin suunnitteluun

DNA:n annealing-lämpötilan laskuri

Tietoa annealing-lämpötilasta

Dokumentaatio