DNA:n liitoslämpötilan laskuri | Ilmainen PCR Tm-työkalu

Mikä on DNA:n alukkeiden kiinnittymislämpötilan laskin?

DNA:n alukkeiden kiinnittymislämpötilan laskin arvioi DNA-alukkeen sulamislämpötilan (Tm) sen sekvenssin perusteella. Tm on lämpötila, jossa puolet alukemolekyyleistä on sitoutunut kohdesäikeeseensä ja puolet ei ole. Polymeraasiketjureaktiossa (PCR) tämä arvo ohjaa lämpötilaa, jossa alukkeet kiinnittyvät DNA-templaattiin.

Miksi kiinnittymislämpötilalla on merkitystä PCR:ssä?

PCR monistaa DNA:n kohdejakson toistuvilla lämmitys- ja jäähdytyssykleillä. Jokaisessa syklissä on kolme vaihetta. Ensin kuumentaminen erottaa kaksijuosteisen templaatti-DNA:n noin lämpötilassa 95 °C. Tätä vaihetta kutsutaan denaturaatioksi. Toiseksi reaktioliuos jäähdytetään alukkeiden kiinnittymislämpötilaan, joka on yleensä 50 °C–65 °C, jotta lyhyet alukkeet voivat sitoutua yksijuosteisten DNA-juosteiden vastaaviin sekvensseihin. Kolmanneksi lämpötila nousee noin lämpötilaan 72 °C, ja DNA-polymeraasi-niminen entsyymi pidentää alukkeita muodostaen uusia DNA-juosteita.

Jos kiinnittymislämpötila on liian matala, alukkeet sitoutuvat sekvensseihin, jotka vastaavat kohdetta vain osittain, ja muodostuu ylimääräisiä, ei-toivottuja DNA-fragmentteja. Jos lämpötila on liian korkea, alukkeet eivät pysty muodostamaan vakaata sidosta templaattiin, ja DNA:ta monistuu vain vähän tai ei lainkaan. Kiinnittymislämpötila on yksi ensimmäisistä asetuksista, joita tutkijat säätävät PCR-reaktion epäonnistuessa.

Miten GC-pitoisuus vaikuttaa Tm-arvoon?

Aluke pariutuu kohteensa kanssa vetysidosten avulla. Guaniini-sytosiinipari (G-C) muodostaa kolme vetysidosta. Adeniini-tymiinipari (A-T) muodostaa kaksi. Aluke, jossa on enemmän G- ja C-emäksiä, vaatii enemmän lämpöä erottuakseen, joten sen Tm on korkeampi kuin yhtä pitkässä alukkeessa, jossa on enemmän A- ja T-emäksiä. GC-pitoisuus ilmoitetaan yleensä prosenttiosuutena: G- ja C-emästen määrä jaettuna sekvenssin kokonaispituudella ja kerrottuna 100:lla.

DNA:n alukkeiden kiinnittymislämpötilan kaava

Tämä laskin käyttää jompaakumpaa kahdesta kaavasta alukkeen pituuden mukaan.

14 nukleotidin pituisille tai pidemmille alukkeille se käyttää Marmur–Doty-kaavaa, joka perustuu GC-pitoisuuteen:

$Tm = 64.9 + 41 \times \frac{(N_{GC} - 16.4)}{N}$

N_GC tarkoittaa alukkeen G- ja C-emästen määrää suoraan laskettuna, ei prosenttiosuutena. N on emästen kokonaismäärä.

14 nukleotidia lyhyemmille alukkeille se käyttää Wallacen sääntöä:

$Tm = 2 \times (A + T) + 4 \times (G + C)$

A, T, G ja C tarkoittavat kukin kyseisen emäksen määrää alukkeessa.

Molemmat kaavat olettavat tavanomaiset PCR-olosuhteet: alukkeen pitoisuus on noin 50 nanomolaaria ja Na+-pitoisuus 50 millimolaaria.

Laskuesimerkki

Tarkastellaan 19 emäksen pituista aluketta ATGCTAGCTAGCTGCTAGC. Sen pituus on 19, mikä on vähintään 14, joten laskin käyttää Marmur–Doty-kaavaa.

• Pituus (N) = 19
• G-emäksiä = 5, C-emäksiä = 5, joten N_GC = 10, ja GC-pitoisuus on 10 / 19 × 100 ≈ 52,6 %
• Tm = 64,9 + 41 × (10 − 16,4) / 19 = 64,9 + 41 × (−6,4) / 19 = 64,9 − 13,8 ≈ 51,1 °C

Kaavassa käytetään GC-emästen lukumäärää 10, ei GC-prosenttiosuutta 52,6. Prosenttiosuuden käyttäminen vahingossa antaa Tm-arvoksi noin 143 °C, mikä ei ole realistinen arvo PCR-reaktiolle, joka tapahtuu lämpötila-alueella 50 °C–95 °C.

Tämän laskimen käyttö

Kirjoita tai liitä alukkeen sekvenssi käyttäen vain kirjaimia A, T, G ja C. Laskin näyttää sekvenssin pituuden nukleotideina (nt), GC-pitoisuuden prosenttiosuutena sekä lasketun kiinnittymislämpötilan celsiusasteina. Tuloksen voi kopioida laboratoriomuistiinpanoihin tai työohjeeseen.

PCR:n kiinnittymislämpötilan valinta

Tm on laskennallinen arvio, ei taattu toimiva lämpötila. Monissa PCR-protokollissa varsinainen kiinnittymisvaihe aloitetaan muutaman asteen laskettua Tm-arvoa alempana ja lämpötilaa säädetään geeliajon tuloksen perusteella. Alukeparin tapauksessa lähtökohdaksi valitaan yleensä alukkeiden kahdesta Tm-arvosta pienempi. Gradientti-PCR:ssä useita reaktioita suoritetaan samanaikaisesti eri lämpötiloissa, ja näin voidaan kokeilemalla löytää sopivin lämpötila.

Muita tapoja arvioida Tm-arvo

Tässä käytetyt Marmur–Doty- ja Wallace-kaavat ovat nopeita approksimaatioita, jotka perustuvat ainoastaan emäskoostumukseen. Muitakin menetelmiä on:

• Lähimmän naapurin termodynamiikka ottaa huomioon sen, miten jokainen vierekkäisten emästen pari vaikuttaa vakauteen, ja sitä pidetään tarkempana menetelmänä tavanomaisille alukkeille.
• Suolapitoisuuden huomioivissa kaavoissa tehdään korjaus reaktiopuskurin Na+- tai K+-ionien pitoisuudelle, koska suurempi suolapitoisuus stabiloi DNA-dupleksia ja nostaa Tm-arvoa.

Eri laskimet voivat ilmoittaa samalle alukkeelle eri Tm-arvoja, koska ne käyttävät eri kaavoja. PCR:n suorittaminen ja tuloksen tarkistaminen on edelleen lopullinen testi.

Usein kysyttyä

Mikä on DNA:n kiinnittymislämpötila?

Se on lämpötila, jossa DNA-alukkeet sitoutuvat templaattisäikeen niitä vastaavaan sekvenssiin PCR:n aikana. Laboratorioissa lämpötila asetetaan yleensä muutaman asteen alukkeelle lasketun sulamislämpötilan (Tm) alapuolelle.

Miten alukkeen Tm lasketaan?

14 emäksen pituisille tai pidemmille alukkeille Tm = 64,9 + 41 × (GC-emästen määrä − 16,4) / pituus. 14 emästä lyhyemmille alukkeille Tm = 2 × (A- ja T-emästen määrä) + 4 × (G- ja C-emästen määrä).

Miksi GC-pitoisuus nostaa Tm-arvoa?

G-C-emäsparit muodostavat kolme vetysidosta, kun taas A-T-parit muodostavat kaksi. Aluke, jossa G- ja C-emästen osuus on suurempi, tarvitsee enemmän energiaa ja siten korkeamman lämpötilan irrotakseen kohteestaan.

Pitäisikö PCR:n kiinnittymislämpötilan olla sama kuin laskettu Tm?

Ei. Useimmissa protokollissa aloitetaan useita asteita lasketun Tm-arvon alapuolelta ja säädetään lämpötilaa siitä lähtien, koska Tm merkitsee kohtaa, jossa vain puolet alukkeesta on sitoutuneena.

Muuttaako alukkeen pituus Tm-arvoa?

Kyllä, mutta ei yksinkertaisella tavalla. Pituus on Marmur–Doty-kaavan nimittäjässä, joten pidempi aluke, jonka GC-pitoisuus on keskitasoa, ei automaattisesti saa korkeampaa Tm-arvoa kuin lyhyempi, GC-rikas aluke.

Miksi eri Tm-laskimet antavat eri tuloksia?

Ne käyttävät eri kaavoja. Wallacen sääntö, Marmur–Doty-kaava, joka perustuu GC-pitoisuuteen, lähimmän naapurin termodynamiikka sekä suolapitoisuuden huomioivat kaavat voivat kaikki antaa samalle alukkeelle eri Tm-arvon, joskus useita asteita toisistaan poikkeavan.

Lähteet

1. Marmur J, Doty P. Deoksiribonukleiinihapon emäskoostumuksen määritys lämpödenaturaatiolämpötilan perusteella. J Mol Biol. 1962;5(1):109-118.
2. Wallace RB, Shaffer J, Murphy RF, Bonner J, Hirose T, Itakura K. Synteettisten oligodeoksiribonukleotidien hybridisaatio phi chi 174 DNA:han. Nucleic Acids Res. 1979;6(11):3543-3557.
3. SantaLucia J Jr. Yhtenäinen näkemys polymeeri-, dumbbell- ja oligOnukleotidi-DNA:n lähimmän naapurin termodynamiikasta. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95(4):1460-1465.