Laske DNA-konsentraatio absorptiolukemista (A260) säädettävillä laimennustekijöillä. Olennaista työkalua molekyylibiologian laboratorioissa ja geneettisessä tutkimuksessa.
DNA-konsentraatio lasketaan seuraavalla kaavalla:
DNA-konsentraatiolaskuri on olennainen verkkotyökalu, joka auttaa molekyylibiologeja, genetiikkoja ja laboratoriohenkilökuntaa määrittämään DNA:n konsentraation tarkasti spektrofotometristen mittausten perusteella. Tämä ilmainen laskuri käyttää standardia A260-menetelmää muuntaakseen UV-absorptiomittaukset tarkkoihin DNA-konsentraatioväriarvoihin ng/μL:ssä.
DNA-konsentraation mittaaminen on perustavanlaatuinen menettely molekyylibiologian laboratorioissa, ja se toimii kriittisenä laadunvalvontavaiheena ennen PCR:ää, sekvensointia, kloonausta ja muita molekyylitekniikoita. Laskurimme poistaa manuaaliset laskelmat ja vähentää virheitä, kun määritetään sekä konsentraatio että DNA:n kokonaismäärä näytteissäsi.
DNA-konsentraation laskeminen perustuu Beer-Lambert-lakiin, joka toteaa, että liuoksen absorbanssi on suoraan verrannollinen liuoksessa olevan absorboivan lajin konsentraatioon ja valon kulkuetäisyyteen liuoksen läpi. Kaksoisjuosteiselle DNA:lle absorbanssi 1.0 260 nm:ssä (A260) 1 cm:n kulkuetäisyydessä kuvetissa vastaa noin 50 ng/μL:n konsentraatiota.
DNA-konsentraatio lasketaan seuraavalla kaavalla:
Missä:
DNA:n kokonaismäärä näytteessä voidaan sitten laskea seuraavasti:
Absorbanssi 260 nm:ssä (A260):
Muuntokerroin (50):
Laimentamiskerroin:
Tilavuus:
Seuraa tätä yksinkertaista prosessia laskeaksesi DNA-konsentraation A260-mittauksistasi:
DNA-konsentraation mittaaminen on välttämätöntä monille molekyylibiologian ja tutkimuksen sovelluksille:
Ennen DNA-fragmenttien ligointia vektoreihin tarkan konsentraation tunteminen mahdollistaa tutkijoiden laskea optimaalisen insertti-vektorisuhteen, maksimoiden transformaation tehokkuuden. Esimerkiksi 3:1 moolisuhde inserttiin ja vektoriin tuottaa usein parhaat tulokset, mikä vaatii tarkkoja konsentraatiomittauksia molemmista komponenteista.
PCR-reaktiot vaativat tyypillisesti 1-10 ng mallidna:ta optimaalista amplifikaatiota varten. Liian vähän DNA:ta voi johtaa amplifikaation epäonnistumiseen, kun taas liian paljon voi estää reaktion. Kvantitatiivisessa PCR:ssä (qPCR) tarvitaan vielä tarkempaa DNA:n kvantifiointia tarkkojen standardikäyrien ja luotettavan kvantifioinnin varmistamiseksi.
NGS-kirjaston valmistusprotokollat määrittävät tarkat DNA-sisääntulo määrät, usein 1-500 ng riippuen alustasta ja sovelluksesta. Tarkka konsentraation mittaaminen on olennaista onnistuneelle kirjaston valmistukselle ja näytteiden tasapainoiselle edustukselle moninkertaisissa sekvensointikierroissa.
Kun DNA:ta tuodaan eukaryoottisiin soluihin, optimaalinen DNA-määrä vaihtelee solutyypin ja transfektiomenetelmän mukaan. Tyypillisesti käytetään 0.5-5 μg plasmididna:ta per hyvin 6-hyvässä levyformaatissa, mikä vaatii tarkkaa konsentraation mittaamista kokeiden standardoimiseksi.
Oikeudellisissa sovelluksissa DNA-näytteet ovat usein rajallisia ja arvokkaita. Tarkka kvantifiointi mahdollistaa oikeusasiantuntijoiden määrittää, onko riittävästi DNA:ta profiilointia varten ja standardoida DNA:n määrä myöhemmissä analyyseissä.
Rajoitusentsyymeillä on erityiset aktiivisuusyksiköt määriteltynä per μg DNA:ta. Tarkan DNA-konsentraation tunteminen mahdollistaa oikeat entsyymi-DNA-suhteet, varmistaen täydellisen hajoamisen ilman tähteitä (epäspesifistä leikkausta).
Vaikka UV-spektrofotometria on yleisin menetelmä DNA:n kvantifioimiseksi, useita vaihtoehtoja on olemassa:
Fluorometriset menetelmät:
Agaroosigeelielektroforeesi:
Reaaliaikainen PCR:
Digitaalinen PCR:
Kyky mitata DNA-konsentraatio tarkasti on kehittynyt merkittävästi molekyylibiologian edistymisen myötä:
Watsonin ja Crickin vuonna 1953 tekemän DNA:n rakenteen löytämisen jälkeen tutkijat alkoivat kehittää menetelmiä DNA:n eristämiseksi ja kvantifioimiseksi. Varhaiset lähestymistavat perustuivat värimittauksiin, kuten diphenylamine-reaktioon, joka tuotti sinisen värin reagoidessaan DNA:n deoksiriboosisokerien kanssa. Nämä menetelmät olivat suhteellisen herkkiä ja alttiita häiriöille.
UV-spektrofotometrian soveltaminen nukleiinihappojen kvantifioimiseen yleistyi 1970-luvulla. Tutkijat havaitsivat, että DNA absorboi UV-valoa maksimaalisesti 260 nm:ssä ja että absorbanssin ja konsentraation välinen suhde oli lineaarinen tietyllä alueella. Kaksoisjuosteisen DNA:n muuntokerroin 50 ng/μL A260:ssä = 1.0 määriteltiin tämän aikakauden aikana.
DNA:ta varten kehitettyjen fluoresoivien värien kehitys 1980- ja 1990-luvuilla mullisti DNA:n kvantifioinnin, erityisesti laimeiden näytteiden osalta. Hoechst-värit ja myöhemmin PicoGreen mahdollistivat paljon herkemmän havaitsemisen kuin mitä spektrofotometrialla oli mahdollista. Nämä menetelmät tulivat erityisen tärkeiksi PCR:n myötä, joka usein vaati tarkkaa kvantifiointia pienistä DNA-määristä.
Mikrovolyymiset spektrofotometrit, kuten NanoDrop, tulivat markkinoille 2000-luvun alussa ja muuttuivat rutiininomaiseksi DNA:n kvantifioinniksi vaatimalla vain 0.5-2 μL näytettä. Tämä teknologia poisti laimennusten ja kuvetin tarpeen, tehden prosessista nopeamman ja kätevämmän.
Nykyään edistyneet tekniikat, kuten digitaalinen PCR ja seuraavan sukupolven sekvensointi, ovat laajentaneet DNA:n kvantifioinnin rajoja entisestään, mahdollistaen spesifisten sekvenssien absoluuttisen kvantifioinnin ja yksittäisten molekyylien havaitsemisen. Kuitenkin perus spektrofotometrinen periaate, joka määriteltiin vuosikymmeniä sitten, pysyy rutiininomaisen DNA-konsentraation mittauksen selkärankana laboratorioissa ympäri maailmaa.
Käydään läpi joitakin käytännön esimerkkejä DNA-konsentraation laskemisesta:
Tutkijalla on puhdistettu plasmidi ja seuraavat mittaukset:
Laskenta:
Verestä eristettyä genomista DNA:ta:
Laskenta:
Sekvensointiprotokolla vaatii tarkasti 500 ng DNA:ta:
Tarvittava tilavuus = 500 ÷ 125 = 4 μL DNA-liuosta
Tässä on esimerkkejä siitä, kuinka laskea DNA-konsentraatio eri ohjelmointikielissä:
1' Excel-kaava DNA-konsentraatiolle
2=A260*50*Laimentamiskerroin
3
4' Excel-kaava kokonais-DNA-määrälle μg:ssä
5=(A260*50*Laimentamiskerroin*Tilavuus)/1000
6
7' Esimerkki solussa, jossa A260=0.5, Laimentamiskerroin=2, Tilavuus=100
8=0.5*50*2*100/1000
9' Tulos: 5 μg
10def calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor=1): """ Laske DNA-konsentraatio ng/μL:ssä Parametrit: absorbance (float): Absorbanssimittaus 260 nm:ssä dilution_factor (float): Näytteen laimentamiskerroin Palauttaa: float: DNA-konsentraatio ng/μL:ssä """ return absorbance * 50 * dilution_factor def calculate_total_dna(concentration, volume_ul): """ Laske kokonais-DNA-määrä μg:ssä Parametrit: concentration (float): DNA-konsentraatio ng/μL
Löydä lisää työkaluja, jotka saattavat olla hyödyllisiä työnkulullesi