DNA-pitoisuuslaskuri

DNA-pitoisuuslaskuri muuntaa 260 nanometrin UV-absorbanssilukeman, jota kutsutaan A260-arvoksi, DNA-pitoisuudeksi nanogrammoina mikrolitrassa (ng/µL). Se ilmoittaa myös näytteen sisältämän DNA:n kokonaismäärän mikrogrammoina (µg).

Mitä A260-absorbanssi on?

A260 on liuoksen 260 nanometrin aallonpituudella absorboiman ultraviolettivalon määrä. DNA absorboi UV-valoa voimakkaimmin tämän aallonpituuden lähellä nukleotidiemästensä vuoksi. Spektrofotometri mittaa A260-arvon nollanäytteen mittauksen jälkeen; nollanäytteessä käytetään samaa puskuria kuin näytteessä, jotta tausta-absorbanssi poistuu. Mitä enemmän liuoksessa on DNA:ta, sitä suurempi A260-lukema on.

DNA-pitoisuuden kaava

Kaksijuosteinen DNA absorboi UV-valoa pitoisuuteensa verrannollisesti; tätä riippuvuutta kutsutaan Beer–Lambertin laiksi. Tavanomaisessa 1 senttimetrin valotiessä liuos, jonka A260-lukema on 1,0, sisältää noin 50 ng/µL kaksijuosteista DNA:ta. Tämä luku, muuntokerroin, muuntaa minkä tahansa A260-lukeman pitoisuudeksi:

DNA-pitoisuus (ng/µL) = A260 × 50 × laimennuskerroin

Laimennuskerroin ottaa huomioon kaiken ennen näytteen mittaamista tehdyn laimennuksen. Ilman laimennusta mitatun näytteen laimennuskerroin on 1.

DNA:n kokonaismäärän laskeminen

Kun pitoisuus tunnetaan, näytteen sisältämän DNA:n kokonaismassa voidaan laskea sen tilavuudesta:

DNA:n kokonaismäärä (µg) = pitoisuus (ng/µL) × tilavuus (µL) ÷ 1000

DNA-pitoisuuden laskeminen vaihe vaiheelta

Sekoita näyte huolellisesti ennen mittaamista. DNA:ta voi tarttua putken seinämiin tai se voi laskeutua epätasaisesti.
Laimenna näyte, jos se on erittäin väkevä, ja pyri A260-lukemaan välillä 0,1–1,0. Spektrofotometrin lukemat ovat tämän alueen ulkopuolella epäluotettavimpia.
Nollaa spektrofotometri samalla laimennukseen käytetyllä puskurilla ja mittaa näyte aallonpituudella 260 nm.
Syötä A260-lukema, näytteen tilavuus ja laimennuskerroin laskuriin, jotta saat pitoisuuden ja kokonaismäärän. Kaikki kolme kenttää on täytettävä, ja tilavuuden on oltava suurempi kuin nolla, ennen kuin tulos tulee näkyviin.

Ratkaistu esimerkki

Esimerkki 1: laimentamaton näyte

A260-lukema on 0,5, laimennusta ei ole tehty (laimennuskerroin 1), ja näytteen tilavuus on 100 µL.

Pitoisuus = 0,5 × 50 × 1 = 25 ng/µL
DNA:n kokonaismäärä = 25 × 100 ÷ 1000 = 2,5 µg

Esimerkki 2: laimennettu näyte

Putkessa on 50 µL puhdistettua DNA:ta. Pieni osa siitä laimennettiin 10-kertaisesti, ja laimennetun osan A260-lukema oli 0,75. Laimennuskerroin muuntaa lukeman takaisin alkuperäisessä putkessa olevan näytteen pitoisuudeksi, ja 50 µL on kokonaismäärän laskentaan syötettävä tilavuus.

Pitoisuus = 0,75 × 50 × 10 = 375 ng/µL
DNA:n kokonaismäärä = 375 × 50 ÷ 1000 = 18,75 µg

Laimennuskertoimen laskeminen

Laimennuskerroin = laimennuksen jälkeinen kokonaistilavuus ÷ alkuperäisen näytteen tilavuus.

Kun 5 µL DNA-liuosta lisätään 45 µL:aan puskuria, kokonaistilavuudeksi saadaan 50 µL, joten laimennuskerroin on 50 ÷ 5 = 10. Laimentamattoman näytteen laimennuskerroin on 1.

DNA-pitoisuuden tyypilliset vaihteluvälit

Pitoisuus riippuu näytetyypistä ja eristysmenetelmästä. Genomisen DNA:n eristeiden pitoisuus on yleensä noin 10–100 ng/µL. Plasmidi-DNA-valmisteissa pitoisuudet ovat usein suurempia, joskus useita satoja ng/µL. Menetelmälle odotetusta alueesta huomattavasti poikkeava tulos voi viitata eristyksen tai itse mittauksen ongelmaan.

UV-absorbanssimittauksen rajoitukset

A260-arvon mittaaminen on nopeaa, mutta se ei ole DNA:n herkin tai spesifisin määritysmenetelmä. Proteiinit, RNA ja jotkin puskurin komponentit absorboivat valoa myös lähellä aallonpituutta 260 nm, mikä voi suurentaa lukemaa. Proteiinikontaminaation seulomiseksi A260/A280-suhde tarkistetaan usein pitoisuuden ohella; suhde lähellä arvoa 1,8 osoittaa yleensä puhdasta DNA-näytettä. Fluoresoivaan väriaineeseen perustuvat menetelmät, kuten Qubit-määritykset, sitoutuvat vain kaksijuosteiseen DNA:han ja antavat tarkemman tuloksen laimeille tai epäpuhtaille näytteille, mutta ne edellyttävät lisäreagensseja ja fluorometriä.

Usein kysyttyä

Miten DNA-pitoisuus lasketaan A260-arvosta?

Kerro A260-lukema 50:llä, joka on kaksijuosteisen DNA:n vakiomuuntokerroin, ja kerro tulos sitten laimennuskertoimella. Jos näytettä ei ole laimennettu, käytä laimennuskerrointa 1.

Mikä on hyvä A260/A280-suhde?

Suhde lähellä arvoa 1,8 osoittaa yleensä puhdasta DNA-näytettä. Pienempi suhde viittaa proteiinikontaminaatioon. Suhde yli 2,0 voi viitata RNA-kontaminaatioon.

Voiko tätä laskuria käyttää RNA:lle?

Ei suoraan, koska RNA:ssa käytetään muuntokerrointa 40 ng/µL kertoimen 50 sijaan. RNA-pitoisuuden arvioimiseksi kerro laskurin tulos luvulla 0,8 (40 ÷ 50) tai käytä suoraan kaavaa A260 × 40 × laimennuskerroin.

Miksi A260-lukeman pitäisi olla välillä 0,1–1,0?

Absorbanssi pysyy Beer–Lambertin lain mukaisesti suurin piirtein verrannollisena pitoisuuteen pääasiassa tällä alueella. Sen ulkopuolella lukemat muuttuvat epäluotettavammiksi, joten liian väkevä tai liian laimea näyte on laimennettava tai väkevöitävä ennen uutta mittausta.

Mikä on pitoisuuden ja puhtauden ero?

Pitoisuus mittaa näytteessä olevan DNA:n määrää yksikössä ng/µL. Puhtaus kuvaa näytteen epäpuhtauksien määrää, jota arvioidaan pääasiassa absorbanssisuhteista, kuten A260/A280-suhteesta. Näytteen pitoisuus voi olla suuri ja näyte silti epäpuhdas, tai pitoisuus voi olla pieni ja näyte erittäin puhdas.

Miten ng/µL muunnetaan yksiköksi µg/mL?

Nämä kaksi yksikköä ovat lukuarvoltaan samat. 1 ng/µL = 1 µg/mL, koska sekä massa- että tilavuusyksikkö skaalautuvat kertoimella 1000.

Lähteet

Sambrook, J. ja Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3. painos). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Gallagher, S. R. ja Desjardins, P. R. (2006). DNA:n ja RNA:n kvantitointi absorptio- ja fluoresenssispektroskopialla. Current Protocols in Molecular Biology, 76(1), A-3D.
Manchester, K. L. (1995). A260/A280-suhteiden merkitys nukleiinihappojen puhtauden mittaamisessa. BioTechniques, 19(2), 208–210.

DNA-pitoisuuslaskuri | A260 - ng/μL -muunnin