DNA-kopiomäärän laskuri | Genomianalyysin työkalu

DNA:n kopiolukumäärän laskin

DNA:n kopiolukumäärän laskin arvioi, kuinka monta kohdesekvenssin kopiota DNA-näytteessä on. Se käyttää lähtötietoina näytteen pitoisuutta ja tilavuutta sekä sitä, kuinka usein kohdesekvenssi esiintyy pidemmässä DNA-sekvenssissä. Molekyylibiologian laboratoriot käyttävät tällaista arviota suunnitellessaan kokeita, kuten qPCR:ää (kvantitatiivista polymeraasiketjureaktiota), ennen kalliimman ja tarkemman määrityksen tekemistä.

Mitä DNA:n kopiolukumäärä tarkoittaa

DNA:n kopiolukumäärä tarkoittaa, kuinka monta kertaa tietty sekvenssi esiintyy genomissa tai näytteessä. Tyypillinen ihmisen geeni esiintyy kaksi kertaa, kerran kummaltakin vanhemmalta perittynä. Kopiolukumäärään voivat vaikuttaa useat tekijät.

• Amplifikaatio: kopioita on enemmän kuin kaksi. Syöpäsolut monistavat usein kasvua edistäviä geenejä, kuten HER2-geeniä joissakin rintakasvaimissa.
• Deleetio: kopioita on vähemmän kuin kaksi, joskus ei lainkaan. Deleetiot voivat aiheuttaa perinnöllisiä sairauksia.
• Duplikaatio: kohtaan, jossa pitäisi olla vain yksi tai kaksi kopiota, ilmestyy ylimääräinen kopio.
• Kopiolukuvaihtelu (CNV): yksilöiden välinen normaali kopiolukumäärän ero, jota esiintyy merkittävässä osassa ihmisen genomia.

DNA:n kopiolukumäärän kaava

Laskin muuntaa sekvenssin esiintymät ja näytteen massan kopiolukumääräksi seuraavan kaavan avulla:

$\text{Kopiolukumäärä} = \frac{\text{Esiintymät} \times \text{Pitoisuus} \times \text{Tilavuus} \times N_A}{\text{DNA:n pituus} \times 660 \times 10^{9}}$

Missä:

• Esiintymät — kuinka monta kertaa kohdesekvenssi esiintyy koko DNA-sekvenssissä; päällekkäiset osumat lasketaan erikseen.
• Pitoisuus — DNA:n pitoisuus nanogrammoina mikrolitraa kohden (ng/μL), joka yleensä mitataan spektrofotometrillä tai fluorometrillä.
• Tilavuus — näytteen tilavuus mikrolitroina (μL).
• $N_A$ — Avogadron vakio, 6,022 × 10²³ molekyyliä moolia kohden. Sen avulla DNA:n ainemäärä muunnetaan molekyylien lukumääräksi.
• DNA:n pituus — koko DNA-sekvenssin pituus emäspareina.
• 660 — yhden DNA-emäsparin keskimääräinen molekyylimassa grammoina moolia kohden (g/mol). Emäspari koostuu kahdesta toisiinsa pariutuneesta nukleotidista, yhdestä kummaltakin DNA-juosteelta.
• 10⁹ — muuntaa nanogrammat grammoiksi.

Kaava muuntaa ensin näytteen massan DNA-molekyylien ainemääräksi, kertoo sen Avogadron vakiolla saadakseen näytteen DNA-molekyylien kokonaismäärän ja kertoo tuloksen sitten sillä, kuinka monta kertaa kohdesekvenssi esiintyy kussakin molekyylissä.

Työkalu hyväksyy vain kirjaimet A, T, C ja G. Välilyönnit ja rivinvaihdot ohitetaan, ja pienet kirjaimet tulkitaan samoin kuin isot kirjaimet.

DNA:n kopiolukumäärän laskeminen: esimerkki

Tarkastellaan 12 emäsparin DNA-sekvenssiä ATCGATCGATCG, jonka kohdesekvenssi on ATCG, pitoisuus 10 ng/μL ja tilavuus 20 μL.

Vaihe 1: Laske esiintymät. ATCG esiintyy 3 kertaa sekvenssissä ATCGATCGATCG (kohdissa 1, 5 ja 9).

Vaihe 2: Selvitä DNA:n kokonaismassa. Pitoisuus × tilavuus = 10 × 20 = 200 ng.

Vaihe 3: Muunna ainemääräksi. 200 ng = 2 × 10⁻⁷ g. Jaetaan luvulla (12 emäsparia × 660 g/mol) = 7 920 g/mol. Tulokseksi saadaan 2,53 × 10⁻¹¹ mol.

Vaihe 4: Muunna molekyylien lukumääräksi. Kerrotaan Avogadron vakiolla: 2,53 × 10⁻¹¹ mol × 6,022 × 10²³ molekyyliä/mol ≈ 1,52 × 10¹³ DNA-molekyyliä.

Vaihe 5: Kerro esiintymien määrällä. 3 × 1,52 × 10¹³ ≈ 4,56 × 10¹³ eli noin 45 621 212 121 212 kopiota.

Luku vaikuttaa valtavalta, koska 20 μL:n näyte, jonka pitoisuus on 10 ng/μL, sisältää silti biljoonia lyhyitä DNA-molekyylejä. Todellisissa näytteissä käytetään yleensä paljon pidempiä sekvenssejä, mikä vähentää molekyylien määrää samalla massalla.

Missä DNA:n kopiolukumäärän analyysiä käytetään

Syöpädiagnostiikka. Patologian laboratoriot tarkistavat HER2-geenin kopiolukumäärän rintakasvainkudoksesta. Normaalissa solussa on kaksi kopiota. Monistuneessa kasvaimessa niitä voi olla kuusi tai enemmän, mikä vaikuttaa kohdennettujen lääkkeiden, kuten trastutsumabin, käyttöedellytyksiin.

Perinnöllisten sairauksien tutkiminen. DiGeorgen oireyhtymän kaltaisiin sairauksiin liittyy kromosomin osan deleetio. Downin oireyhtymässä on ylimääräinen kopio kromosomista 21 (trisomia 21). Kopioiden laskeminen auttaa varmistamaan nämä diagnoosit.

Transgeenien ja plasmidien kvantifiointi. Tutkijat selvittävät, kuinka monta insertoidun geenin kopiota on siirtynyt kasvi-, eläin- tai bakteerisoluun. Yhtä kopiota suositaan yleensä, koska useat kopiot voivat saada solun vaimentamaan geenin ilmentymistä.

Patogeenien ja viruskuorman seuranta. Kopiolukumääräarvioilla seurataan, kuinka paljon virus- tai bakteeri-DNA:ta näytteessä on. Tätä käytetään infektioiden seurannassa ja ympäristötestauksessa.

Muita menetelmiä kopiolukumäärän mittaamiseen

Tämä laskin antaa nopean arvion sekvenssi- ja pitoisuustietojen perusteella. Tarkempaa tulosta tarvitsevat laboratoriot käyttävät yleensä jotakin seuraavista menetelmistä:

• Kvantitatiivinen PCR (qPCR): monistaa ja mittaa DNA:ta reaaliaikaisesti; hyvällä standardisuoralla tarkkuus on noin 15–20%.
• Digitaalinen PCR (dPCR): jakaa näytteen tuhansiin pieniin reaktioihin suoraa laskemista varten ilman standardisuoraa.
• In situ -hybridisaatio fluoresenssilla (FISH): sekvenssit lasketaan visuaalisesti mikroskoopilla suoraan soluista tai kromosomeista; menetelmä on vakiintunut monissa syöpädiagnostiikan laboratorioissa.
• Uuden sukupolven sekvensointi (NGS): sekvensoi koko näytteen ja määrittää genomien kopioluvut samanaikaisesti.

Usein kysyttyä

Mikä on DNA:n kopiolukumäärä? Se tarkoittaa, kuinka monta kertaa tietty DNA-sekvenssi esiintyy genomissa tai näytteessä. Useimmat ihmisen geenit esiintyvät kaksi kertaa, kerran kummaltakin vanhemmalta. Ylimääräiset tai puuttuvat kopiot voivat vaikuttaa terveyteen ja sairausriskiin.

Kuinka tarkka tämä laskin on? Se antaa syötettyihin arvoihin perustuvan teoreettisen arvion, ei laboratoriomittausta. Tarkkuus riippuu siitä, kuinka täsmällisesti pitoisuus on mitattu ja kuinka spesifinen kohdesekvenssi on. Digitaalisen PCR:n kaltaiset menetelmät ovat tarkempia julkaistavia tuloksia varten.

Voiko tätä laskinta käyttää RNA:lle? Ei. RNA:ssa tymiinin sijaan on urasiili ja sokeriosa on erilainen, joten sen molekyylimassa poikkeaa DNA:n molekyylimassasta. RNA:n keskimääräinen molekyylimassa nukleotidia kohden on noin 330 g/mol, kun taas DNA:n emäsparia kohden se on noin 660 g/mol. DNA:n kaavan käyttäminen RNA-tietoihin antaisi väärän tuloksen.

Miksi päällekkäinen sekvenssi lasketaan useammin kuin kerran? Laskin laskee jokaisen kohdan, jossa kohde täsmää, vaikka osumat jakaisivat samoja kirjaimia. Sekvenssi ATA täsmää sekvenssissä ATATAT kaksi kertaa, kohdassa 1 ja kohdassa 3, koska jokainen aloituskohta tarkistetaan erikseen.

Mikä DNA-pitoisuusalue toimii parhaiten? Pitoisuudet 10–100 ng/μL antavat luotettavimmat lukemat tavanomaisilla laboratoriolaitteilla. Alle 10 ng/μL:n pitoisuuksilla mittausvirhe kasvaa, ja tavallisen spektrofotometrin sijaan suositellaan herkemmällä menetelmällä, kuten fluorometrillä, tehtävää mittausta.

Voiko tällä laskimella arvioida plasmidin kopiolukumäärää? Kyllä. Syötä DNA-sekvenssiksi koko plasmidisekvenssi ja kohdesekvenssiksi insertin ainutlaatuinen alue sekä mitattu plasmidipitoisuus ja näytteen tilavuus.