DNA Ligation Calculator

Johdanto

DNA-ligaatio on keskeinen molekyylibiologian tekniikka, jota käytetään DNA-fragmenttien liittämiseen toisiinsa kovalenttisilla sidoksilla. DNA Ligation Calculator on olennainen työkalu tutkijoille, joka auttaa määrittämään optimaalisen määrän vektori- ja insert-DNA:ta onnistuneita ligaatioreaktioita varten. Laskemalla oikeat moolisuhteet vektori- (plasmidi) ja insert-DNA-fragmenttien välillä tämä laskuri varmistaa tehokkaat molekyylikloonauksen kokeet samalla kun se minimoi hukatut reagenssit ja epäonnistuneet reaktiot.

Ligaatioreaktiot ovat perustavanlaatuisia geeniteknologiassa, synteettisessä biologiassa ja molekyylikloonauksen menettelyissä. Ne mahdollistavat tiedemiesten luoda rekombinantteja DNA-molekyylejä lisäämällä kiinnostavia geenejä plasmidivektoreihin, jotta ne voidaan myöhemmin siirtää isäntäorganismeihin. Näiden reaktioiden onnistuminen riippuu suuresti käytettyjen DNA-komponenttien oikeista määristä, mikä on juuri se, mitä tämä laskuri auttaa määrittämään.

Olitpa rakentamassa ilmentymävektoreita, luomassa geenikirjastoja tai suorittamassa rutiinialikloonauksia, tämä DNA-ligaatiolaskuri auttaa sinua optimoimaan kokeelliset olosuhteesi ja lisäämään onnistumisprosenttiasi. Syöttämällä muutamia keskeisiä parametreja DNA-näytteistäsi voit nopeasti saada tarkat volyymit, joita tarvitaan erityiseen ligaatioreaktioosi.

Kaava/Laskenta

DNA-ligaatiolaskuri käyttää perustavanlaatuista molekyylibiologian kaavaa, joka ottaa huomioon eri kokoisten ja pitoisten DNA-fragmenttien yhdistämisen. Pääasiallinen laskenta määrittää, kuinka paljon insert-DNA:ta tarvitaan suhteessa vektori-DNA:han niiden pituuksien ja halutun moolisuhteen perusteella.

Insertin Määrän Laskenta

Tarvittava insert-DNA-määrä (nanogrammoina) lasketaan seuraavalla kaavalla:

$\text{ng of insert} = \text{ng of vector} \times \frac{\text{kb size of insert}}{\text{kb size of vector}} \times \text{molar ratio}$

Missä:

• ng of vector = käytettävän vektori-DNA:n määrä reaktiossa (tyypillisesti 50-100 ng)
• kb size of insert = insert-DNA-fragmentin pituus kilobiteinä (kb)
• kb size of vector = vektori-DNA:n pituus kilobiteinä (kb)
• molar ratio = haluttu suhde insert-molekyylien ja vektori-molekyylien välillä (tyypillisesti 3:1 - 5:1)

Tilavuuslaskennat

Kun tarvittava insert-DNA-määrä on määritetty, reaktion tarvitsevat volyymit lasketaan:

$\text{Vector volume (μL)} = \frac{\text{ng of vector}}{\text{vector concentration (ng/μL)}}$

$\text{Insert volume (μL)} = \frac{\text{ng of insert}}{\text{insert concentration (ng/μL)}}$

$\text{Buffer/water volume (μL)} = \text{Total reaction volume (μL)} - \text{Vector volume (μL)} - \text{Insert volume (μL)}$

Esimerkkilaskenta

Käydään läpi käytännön esimerkki:

• Vektorin pitoisuus: 50 ng/μL
• Vektorin pituus: 3000 bp (3 kb)
• Insertin pitoisuus: 25 ng/μL
• Insertin pituus: 1000 bp (1 kb)
• Haluttu moolisuhde (insert:vektori): 3:1
• Kokonaisreaktiovolyymi: 20 μL
• Käytettävä vektorin määrä: 50 ng

Vaihe 1: Laske tarvittava insert-määrä $\text{ng of insert} = 50 \text{ ng} \times \frac{1 \text{ kb}}{3 \text{ kb}} \times 3 = 50 \times 0.33 \times 3 = 50 \text{ ng}$

Vaihe 2: Laske volyymit $\text{Vector volume} = \frac{50 \text{ ng}}{50 \text{ ng/μL}} = 1 \text{ μL}$

$\text{Insert volume} = \frac{50 \text{ ng}}{25 \text{ ng/μL}} = 2 \text{ μL}$

$\text{Buffer/water volume} = 20 \text{ μL} - 1 \text{ μL} - 2 \text{ μL} = 17 \text{ μL}$

Tämä laskenta varmistaa, että reaktiossa on kolme insert-molekyyliä jokaista vektori-molekyyliä kohden, mikä optimoi onnistuneen ligaation mahdollisuuksia.

Vaiheittainen Opas Laskurin Käyttöön

DNA Ligation Calculatorimme on suunniteltu intuitiiviseksi ja yksinkertaiseksi. Seuraa näitä vaiheita laskiaksesi optimaalista volyymiä ligaatioreaktiollesi:

1. Syötä Vektorin Tiedot:

   • Syötä vektorin pitoisuus ng/μL
   • Anna vektorin pituus baseina (bp)
   • Määritä käytettävän vektori-DNA:n määrä reaktiossa (ng)

2. Syötä Insertin Tiedot:

   • Syötä insertin pitoisuus ng/μL
   • Anna insertin pituus baseina (bp)

3. Aseta Reaktioparametrit:

   • Määritä haluttu moolisuhde (insert:vektori) - tyypillisesti 3:1 - 5:1
   • Syötä kokonaisreaktiovolyymi μL (yleensä 10-20 μL)

4. Näe Tulokset:

   • Laskuri näyttää automaattisesti:
     • Tarvittava vektorin volyymi (μL)
     • Tarvittava insertin volyymi (μL)
     • Lisättävä puskurin/veden volyymi (μL)
     • Kokonaisreaktiovolyymi (μL)
     • Vektori- ja insert-DNA:n määrä reaktiossa (ng)

5. Kopioi Tulokset (valinnainen):

   • Käytä "Kopioi Tulokset" -painiketta kopioidaksesi kaikki laskelmat leikepöydälle laboratorio- tai protokollamuistiin

Laskuri suorittaa validointitarkistuksia varmistaakseen, että kaikki syötteet ovat positiivisia lukuja ja että kokonaisvolyymi on riittävä vaadittaville DNA-volyymeille. Jos virheitä havaitaan, hyödylliset virheilmoitukset ohjaavat sinua korjaamaan syötteet.

Käyttötapaukset

DNA Ligation Calculator on arvokas monilla molekyylibiologian sovellusalueilla:

Molekyylikloonaus

Yleisin käyttötapa on perinteinen molekyylikloonaus, jossa tutkijat lisäävät geenejä tai DNA-fragmentteja plasmidivektoreihin. Laskuri varmistaa optimaaliset olosuhteet:

• Alikloonauksen geenejä eri ilmentymävektoreiden välillä
• Fuusioproteiinien luominen yhdistämällä useita geenifragmentteja
• Ilmaisingeenikokeiden rakentaminen
• Plasmidikirjastojen luominen

Synteettinen Biologia

Synteettisessä biologissa, jossa useita DNA-fragmentteja usein kootaan:

• Gibson Assembly -reaktiot hyötyvät tarkasta insert:vektori-suhteesta
• Golden Gate -kokoamisjärjestelmät vaativat erityisiä DNA-pitoisuuksia
• BioBrick-kokoaminen standardoitujen geneettisten osien
• Synteettisten geneettisten piireiden rakentaminen

Diagnostisten Testien Kehittäminen

Kun kehitetään molekyylidiagnostisia työkaluja:

• Taudin erityisten geneettisten markkereiden kloonaus
• Positiivisten kontrolliplasmidien rakentaminen
• qPCR: n kalibrointistandardien kehittäminen

Proteiinien Ilmentymäjärjestelmät

Tutkijoille, jotka työskentelevät proteiinintuotannon parissa:

• Insert:vektori-suhteiden optimointi korkeakopioisille ilmentymävektoreille
• Indusoitavien ilmentymäjärjestelmien rakentaminen
• Proteiinipuhdistusta varten salpausvektorien luominen

CRISPR-Cas9 Sovellukset

Genomitason muokkauksessa:

• Opas-RNA: n kloonaaminen CRISPR-vektoreihin
• Luonnollisten mallien luominen homologiaohjattua korjausta varten
• Opas-RNA-kirjastojen rakentaminen seulontaa varten

Haastavat Ligaatiot

Laskuri on erityisen arvokas haastavissa ligaatiotilanteissa:

• Suurten insertien kloonaus (>5 kb)
• Erittäin pienten fragmenttien lisäämiset (<100 bp)
• Blunt-end-ligaatiot, joilla on alhaisempi tehokkuus
• Monifragmenttikokoamisreaktiot

Vaihtoehdot

Vaikka DNA Ligation Calculatorimme tarjoaa tarkkoja laskelmia perinteisille ligaatioreaktioille, useita vaihtoehtoisia lähestymistapoja DNA-fragmenttien yhdistämiseen on olemassa:

1. Gibson Assembly: Käyttää exonukleaasia, polymeraasia ja ligaasia yhdessä putkireaktiossa yhdistämään päällekkäisiä DNA-fragmentteja. Perinteistä ligaatiolaskentaa ei tarvita, mutta pitoisuussuhteet ovat edelleen tärkeitä.

2. Golden Gate Assembly: Käyttää tyyppi IIS -rajoitusentsyymejä suuntaavaan, arpia poistavaan kokoamiseen useista fragmentteista. Vaatii equimolaarisia määriä kaikkia fragmentteja.

3. SLIC (Sekvenssi- ja Ligaatiovapaa Kloonaus): Käyttää exonukleaasia luomaan yksijuosteisia ulokkeita, jotka liittävät yhteen. Käyttää tyypillisesti equimolaarisia suhteita fragmenttien välillä.

4. In-Fusion Kloonaus: Kaupallinen järjestelmä, joka mahdollistaa fragmenttien yhdistämisen 15 bp:n päällekkäisyyksillä. Käyttää erityistä suhdetta fragmenttien kokojen perusteella.

5. Gateway Kloonaus: Käyttää sivu-spesifistä rekombinaatiota ligaation sijaan. Vaatii erityisiä sisääntulo- ja määritysvektoreita.

6. Empiirinen Testaus: Jotkut laboratoriot suosivat useiden ligaatioreaktioiden asettamista eri insert:vektori-suhteilla (1:1, 3:1, 5:1, 10:1) ja määrittävät, mikä toimii parhaiten heidän erityisrakenteissaan.

7. Ohjelmistolaskurit: Kaupalliset ohjelmistopaketit, kuten Vector NTI ja SnapGene, sisältävät ligaatiolaskureita, joilla on lisäominaisuuksia, kuten rajoituspaikan analyysi.

Historia

DNA-ligaatiolaskentojen kehitys kulkee käsi kädessä molekyylikloonauksen tekniikoiden kehityksen kanssa, jotka ovat vallankumouksellisia molekyylibiologiassa ja bioteknologiassa.

Varhaiset Kehitykset (1970-luku)

DNA-ligaation käsite molekyylikloonauksessa syntyi 1970-luvun alussa Paul Bergin, Herbert Boyerin ja Stanley Cohenin pioneerin työn myötä, jotka kehittivät ensimmäiset rekombinantit DNA-molekyylit. Tänä aikana ligaatioreaktiot olivat suurelta osin empiirisiä, ja tutkijat käyttivät kokeilua ja virheitä määrittääkseen optimaaliset olosuhteet.

Rajoitusentsyymien ja DNA-ligaasin löytäminen tarjosi olennaiset työkalut DNA-molekyylien leikkaamiseen ja yhdistämiseen. T4 DNA-ligaasi, joka eristettiin T4 bakteriofagilla infektoiduista E. coli -bakteereista, tuli standardientsyymiksi DNA-fragmenttien yhdistämiseen sen kyvyn vuoksi ligatoida sekä tylppä- että koherentteja päitä.

Hienosäätökausi (1980-1990-luku)

Kun molekyylikloonaus muuttui yhä tavallisemmaksi, tutkijat alkoivat kehittää järjestelmällisempiä lähestymistapoja ligaatioreaktioihin. Ymmärrys insert- ja vektori-DNA:n moolisuhteiden tärkeydestä tuli ilmeiseksi, mikä johti perustavanlaatuisten kaavojen kehittämiseen, joita käytetään edelleen tänä päivänä.

Tänä aikana tutkijat havaitsivat, että ylimääräinen insert-DNA (tyypillisesti 3:1 - 5:1 moolisuhde insert:vektori) paransi yleensä ligaation tehokkuutta perinteisissä kloonaussovelluksissa. Tämä tieto jaettiin aluksi laboratorio-protokollien kautta ja päätyi vähitellen molekyylibiologian oppaisiin ja oppikirjoihin.

Moderni Aika (2000-luku - Nykyhetki)

Laskennallisten työkalujen ja verkkolaskureiden syntyminen 2000-luvulla teki tarkkojen ligaatiolaskentojen helpommin saatavilla oleviksi tutkijoille. Kun molekyylibiologian tekniikoista tuli yhä monimutkaisempia, tarkkojen laskentojen tarve kasvoi, erityisesti haastavissa kloonausprojekteissa, joissa oli useita fragmentteja tai suuria inserttejä.

Nykyään DNA-ligaatiolaskennat ovat olennainen osa molekyylikloonauksen työnkulkuja, ja omistautuneet laskurit, kuten tämä, auttavat tutkijoita optimoimaan kokeitaan. Perustava kaava on pysynyt suurelta osin muuttumattomana, vaikka ymmärryksemme ligaation tehokkuuteen vaikuttavista tekijöistä on parantunut.

Vaihtoehtoisten kloonausmenetelmien, kuten Gibson Assemblyn ja Golden Gate -kloonaamisen, syntyminen on tuonut uusia laskentarakenteita, mutta DNA-fragmenttien välillä käytettävien moolisuhteiden peruskäsite pysyy tärkeänä näissä tekniikoissa.

Koodiesimerkit

Tässä on toteutuksia DNA-ligaatiolaskurista eri ohjelmointikielillä:

1' Excel VBA -toiminto DNA-ligaatiolaskurille
2Function CalculateInsertAmount(vectorAmount As Double, vectorLength As Double, insertLength As Double, molarRatio As Double) As Double
3    ' Laske tarvittava insert-määrä ng
4    CalculateInsertAmount = vectorAmount * (insertLength / vectorLength) * molarRatio
5End Function
6
7Function CalculateVectorVolume(vectorAmount As Double, vectorConcentration As Double) As Double
8    ' Laske vektorin volyymi μL
9    CalculateVectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration
10End Function
11
12Function CalculateInsertVolume(insertAmount As Double, insertConcentration As Double) As Double
13    ' Laske insertin volyymi μL
14    CalculateInsertVolume = insertAmount / insertConcentration
15End Function
16
17Function CalculateBufferVolume(totalVolume As Double, vectorVolume As Double, insertVolume As Double) As Double
18    ' Laske puskurin/veden volyymi μL
19    CalculateBufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume
20End Function
21
22' Esimerkin käyttö solussa:
23' =CalculateInsertAmount(50, 3000, 1000, 3)
24

1def calculate_ligation_volumes(vector_concentration, vector_length, insert_concentration, 
2                              insert_length, molar_ratio, total_volume, vector_amount=50):
3    """
4    Laske volyymit DNA-ligaatioreaktiota varten.
5    
6    Parametrit:
7    vector_concentration (float): Vektori-DNA:n pitoisuus ng/μL
8    vector_length (float): Vektori-DNA:n pituus baseina
9    insert_concentration (float): Insert-DNA:n pitoisuus ng/μL
10    insert_length (float): Insert-DNA:n pituus baseina
11    molar_ratio (float): Haluttu moolisuhde insert:vektori
12    total_volume (float): Kokonaisreaktiovolyymi μL
13    vector_amount (float): Käytettävä vektori-DNA:n määrä ng (oletus: 50)
14    
15    Palauttaa:
16    dict: Sanakirja, joka sisältää lasketut volyymit ja määrät
17    """
18    # Laske vektorin volyymi
19    vector_volume = vector_amount / vector_concentration
20    
21    # Laske tarvittava insert-määrä
22    vector_length_kb = vector_length / 1000
23    insert_length_kb = insert_length / 1000
24    insert_amount = (vector_amount * insert_length_kb / vector_length_kb) * molar_ratio
25    
26    # Laske insertin volyymi
27    insert_volume = insert_amount / insert_concentration
28    
29    # Laske puskurin/veden volyymi
30    buffer_volume = total_volume - vector_volume - insert_volume
31    
32    return {
33        "vector_volume": round(vector_volume, 2),
34        "insert_volume": round(insert_volume, 2),
35        "buffer_volume": round(buffer_volume, 2),
36        "insert_amount": round(insert_amount, 2),
37        "vector_amount": vector_amount
38    }
39
40# Esimerkin käyttö
41result = calculate_ligation_volumes(
42    vector_concentration=50,
43    vector_length=3000,
44    insert_concentration=25,
45    insert_length=1000,
46    molar_ratio=3,
47    total_volume=20
48)
49
50print(f"Vektori: {result['vector_volume']} μL ({result['vector_amount']} ng)")
51print(f"Insert: {result['insert_volume']} μL ({result['insert_amount']} ng)")
52print(f"Puskuri: {result['buffer_volume']} μL")
53print(f"Kokonais: 20 μL")
54

1function calculateLigationVolumes(vectorConcentration, vectorLength, insertConcentration, 
2                                insertLength, molarRatio, totalVolume, vectorAmount = 50) {
3  // Muunna pituudet kb:ksi laskentaa varten
4  const vectorLengthKb = vectorLength / 1000;
5  const insertLengthKb = insertLength / 1000;
6  
7  // Laske tarvittava insert-määrä
8  const insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
9  
10  // Laske volyymit
11  const vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
12  const insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
13  const bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
14  
15  return {
16    vectorVolume: parseFloat(vectorVolume.toFixed(2)),
17    insertVolume: parseFloat(insertVolume.toFixed(2)),
18    bufferVolume: parseFloat(bufferVolume.toFixed(2)),
19    insertAmount: parseFloat(insertAmount.toFixed(2)),
20    vectorAmount: vectorAmount
21  };
22}
23
24// Esimerkin käyttö
25const result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
26console.log(`Vektori: ${result.vectorVolume} μL (${result.vectorAmount} ng)`);
27console.log(`Insert: ${result.insertVolume} μL (${result.insertAmount} ng)`);
28console.log(`Puskuri: ${result.bufferVolume} μL`);
29console.log(`Kokonais: 20 μL`);
30

1public class DNALigationCalculator {
2    public static class LigationResult {
3        public final double vectorVolume;
4        public final double insertVolume;
5        public final double bufferVolume;
6        public final double insertAmount;
7        public final double vectorAmount;
8        
9        public LigationResult(double vectorVolume, double insertVolume, double bufferVolume, 
10                             double insertAmount, double vectorAmount) {
11            this.vectorVolume = vectorVolume;
12            this.insertVolume = insertVolume;
13            this.bufferVolume = bufferVolume;
14            this.insertAmount = insertAmount;
15            this.vectorAmount = vectorAmount;
16        }
17    }
18    
19    public static LigationResult calculateLigationVolumes(
20            double vectorConcentration, double vectorLength, 
21            double insertConcentration, double insertLength,
22            double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount) {
23        
24        // Muunna pituudet kb:ksi
25        double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
26        double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
27        
28        // Laske tarvittava insert-määrä
29        double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
30        
31        // Laske volyymit
32        double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
33        double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
34        double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
35        
36        // Pyöristä 2 desimaaliin
37        vectorVolume = Math.round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
38        insertVolume = Math.round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
39        bufferVolume = Math.round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
40        insertAmount = Math.round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
41        
42        return new LigationResult(vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount);
43    }
44    
45    public static void main(String[] args) {
46        LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20, 50);
47        
48        System.out.printf("Vektori: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.vectorVolume, result.vectorAmount);
49        System.out.printf("Insert: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.insertVolume, result.insertAmount);
50        System.out.printf("Puskuri: %.2f μL%n", result.bufferVolume);
51        System.out.printf("Kokonais: 20 μL%n");
52    }
53}
54

1#include <iostream>
2#include <cmath>
3#include <iomanip>
4
5struct LigationResult {
6    double vectorVolume;
7    double insertVolume;
8    double bufferVolume;
9    double insertAmount;
10    double vectorAmount;
11};
12
13LigationResult calculateLigationVolumes(
14    double vectorConcentration, double vectorLength,
15    double insertConcentration, double insertLength,
16    double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount = 50.0) {
17    
18    // Muunna pituudet kb:ksi
19    double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
20    double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
21    
22    // Laske tarvittava insert-määrä
23    double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
24    
25    // Laske volyymit
26    double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
27    double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
28    double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
29    
30    // Pyöristä 2 desimaaliin
31    vectorVolume = std::round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
32    insertVolume = std::round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
33    bufferVolume = std::round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
34    insertAmount = std::round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
35    
36    return {vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount};
37}
38
39int main() {
40    LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
41    
42    std::cout << std::fixed << std::setprecision(2);
43    std::cout << "Vektori: " << result.vectorVolume << " μL (" << result.vectorAmount << " ng)" << std::endl;
44    std::cout << "Insert: " << result.insertVolume << " μL (" << result.insertAmount << " ng)" << std::endl;
45    std::cout << "Puskuri: " << result.bufferVolume << " μL" << std::endl;
46    std::cout << "Kokonais: 20 μL" << std::endl;
47    
48    return 0;
49}
50

Usein Kysytyt Kysymykset (UKK)

Mikä on optimaalinen moolisuhde DNA-ligaatiolle?

Optimaalinen insert:vektori-moolisuhde vaihtelee yleensä 3:1 - 5:1 perinteisissä kloonaussovelluksissa. Tämä voi kuitenkin vaihdella erityisten ligaatiotilanteiden mukaan:

• Blunt-end ligaatiot: 3:1 - 5:1
• Sticky-end ligaatiot: 1:1 - 3:1
• Suuret insertit (>10 kb): 1:1 - 2:1
• Pienet insertit (<500 bp): 5:1 - 10:1
• Monifragmenttikokoaminen: 3:1 jokaiselle insertille vektoriin

Miksi ligaatioreaktioni epäonnistuu huolimatta laskettujen volyymien käytöstä?

Useat tekijät voivat vaikuttaa ligaation tehokkuuteen moolisuhteen lisäksi:

1. DNA:n laatu: Varmista, että sekä vektori että insertillä on puhtaat päät ilman vaurioita
2. Dephosphorylaatio: Tarkista, onko vektorisi dephosphoryloitu, mikä estää itse ligaation
3. Entsyymin aktiivisuus: Varmista, että ligaasisi on aktiivinen ja käytetään oikeassa lämpötilassa
4. Inkubointiaika: Jotkin ligaatiot hyötyvät pidemmästä inkuboinnista (yö yli 16°C)
5. Puskuriolosuhteet: Varmista, että käytetään oikeaa puskuria, jossa on ATP
6. Saasteet: Puhdista DNA estäjien, kuten EDTA:n tai korkean suolan, poistamiseksi

Kuinka paljon vektori-DNA:ta minun pitäisi käyttää ligaatioreaktiossa?

Tyypillisesti 50-100 ng vektori-DNA:ta suositellaan standardeille ligaatioreaktioille. Liian suuri vektorin määrä voi johtaa suurempaan taustaan leikkaamattomasta tai itse ligaatiosta, kun taas liian pieni voi vähentää transformaation tehokkuutta. Haastavissa ligaatioissa saatat joutua optimoimaan tämän määrän.

Tulenko säätää laskelmia blunt-end- ja sticky-end-ligaatioille?

Kyllä. Blunt-end ligaatiot ovat yleensä vähemmän tehokkaita kuin sticky-end (koherentit) ligaatiot. Blunt-end ligaatioissa käytetään yleensä:

• Korkeampia moolisuhteita (3:1 - 5:1 tai jopa korkeampia)
• Enemmän T4 DNA-ligaasia (tyypillisesti 2-3 kertaa enemmän)
• Pidempiä inkubointiaikoja
• Harkitse PEG:n lisäämistä ligaation tehokkuuden parantamiseksi

Kuinka lasken ligaation useille inserteille?

Useiden fragmenttien kokoamisessa:

1. Laske jokaisen insertin määrä erikseen käyttäen samaa kaavaa
2. Pidä sama kokonaismoolisuhde (esim. kahdelle insertille, käytä 1.5:1.5:1 insert1:insert2:vektori)
3. Säädä kokonaisreaktiovolyymi kaikkien DNA-fragmenttien mahtumiseksi
4. Harkitse peräkkäistä ligaatiota tai käytä kokoamismenetelmiä, kuten Gibson Assembly, useille fragmenteille

Voinko käyttää tätä laskuria Gibson Assemblyn tai Golden Gate Assemblyn kanssa?

Tämä laskuri on erityisesti suunniteltu perinteisille rajoitusentsyymi- ja ligaasipohjaisille kloonauksille. Gibson Assemblylle suositellaan yleensä equimolaarisia määriä kaikkia fragmentteja (1:1 suhde), vaikka DNA-määrän laskenta pituuden perusteella onkin samankaltaista. Golden Gate Assemblylle vaaditaan myös equimolaarisia määriä kaikkia komponentteja.

Kuinka otan huomioon vektorin dephosphorylaation laskennoissani?

Vektorin dephosphorylaatio (5' fosfaattiryhmien poistaminen) estää itse ligaation, mutta se ei muuta määrälaskentaa. Dephosphoryloiduissa vektoreissa:

1. Käytä tuoretta insert-DNA:ta, jossa on ehjät 5' fosfaatit
2. Harkitse hieman korkeampia insert:vektori-suhteita (4:1 - 6:1)
3. Varmista pidemmät ligaatiot (vähintään 1 tunti huoneenlämmössä tai yö yli 16°C)

Mikä on vähimmäiskokonaisreaktiovolyymini?

Vähimmäiskäytännön reaktiovolyymi on tyypillisesti 10 μL, mikä mahdollistaa riittävän sekoittamisen ja estää haihtumisongelmat. Jos laskemasi DNA-volyymit ylittävät halutun reaktiovolyymin, sinulla on useita vaihtoehtoja:

1. Käytä tiheämpiä DNA-näytteitä
2. Säädä vektorin käytettävää määrää (esim. 25 ng 50 ng:n sijaan)
3. Lisää kokonaisreaktiovolyymiä
4. Harkitse DNA-näytteiden tiivistämistä

Kuinka kauan minun pitäisi inkuboida ligaatioreaktiotani?

Optimaaliset inkubointiajat vaihtelevat ligaation tyypin mukaan:

• Sticky-end ligaatiot: 1 tunti huoneenlämmössä (22-25°C) tai 4-16 tuntia 16°C:ssa
• Blunt-end ligaatiot: 2-4 tuntia huoneenlämmössä tai yö yli (12-16 tuntia) 16°C:ssa
• Nopeat ligaatiot (käyttäen korkeapitoista ligaasia): 5-15 minuuttia huoneenlämmössä

Voinko käyttää jäljelle jäänyttä ligaatioreaktiota transformaatiota varten?

Kyllä, ligaatiomiksejä voidaan tyypillisesti varastoida -20°C:ssa ja käyttää uudelleen transformaatiota varten. Kuitenkin jokainen jäädytys-sulatusjakso voi vähentää tehokkuutta. Parhaiden tulosten saavuttamiseksi:

1. Alikvotoi ligaatiomikstuurat ennen jäädyttämistä
2. Lämmitä ligaasia inaktivoidaksesi (65°C 10 minuutiksi) ennen varastointia
3. Käytä 1-2 kuukauden kuluessa optimaalisten tulosten saavuttamiseksi

Viitteet

1. Sambrook J, Russell DW. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3. painos). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

2. Green MR, Sambrook J. (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4. painos). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

3. Engler C, Kandzia R, Marillonnet S. (2008). A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS ONE, 3(11), e3647. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003647

4. Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. (2009). Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods, 6(5), 343-345. https://doi.org/10.1038/nmeth.1318

5. Aslanidis C, de Jong PJ. (1990). Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research, 18(20), 6069-6074. https://doi.org/10.1093/nar/18.20.6069

6. Zimmerman SB, Pheiffer BH. (1983). Macromolecular crowding allows blunt-end ligation by DNA ligases from rat liver or Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences, 80(19), 5852-5856. https://doi.org/10.1073/pnas.80.19.5852

7. Addgene - Molecular Biology Reference. https://www.addgene.org/mol-bio-reference/

8. New England Biolabs (NEB) - DNA Ligation Protocol. https://www.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202

9. Thermo Fisher Scientific - Molecular Cloning Technical Reference. https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center.html

10. Promega - Cloning Technical Manual. https://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/cloning/