DNA-ligaatiolaskuri - Laske Insert:Vektori-suhteet molekyylikloonauksessa

DNA-ligaatio on molekyylikloonauksen vaihe, jossa inserttifragmentti liitetään plasmidivektoriin T4-DNA-ligaasin avulla. DNA-ligaatiolaskuri laskee, kuinka monta mikrolitraa insertti-DNA:ta ja vektori-DNA:ta tulee sekoittaa, jotta reaktiossa saavutetaan valittu insertin ja vektorin välinen moolisuhde.

Mitä laskin tekee

Laskuri ottaa kuusi syöttötietoa: vektorin konsentraation, vektorin pituuden, insertin konsentraation, insertin pituuden, insertin ja vektorin tavoitemoolisuhteen sekä reaktion kokonaistilavuuden. Käyttäjä voi myös määrittää käytettävän vektori-DNA:n määrän; oletusarvo on 50 nanogrammaa (ng). Näiden arvojen perusteella laskuri laskee pipetoitavan vektorin tilavuuden, pipetoitavan insertin tilavuuden sekä tarvittavan puskurin tai veden määrän, jotta reaktion kokonaistilavuus saavutetaan.

Pitoisuus mitataan nanogrammoina mikrolitraa kohti (ng/μL), ja se luetaan yleensä NanoDrop- tai Qubit-laitteella. Pituus ilmoitetaan emäspareina (bp). Yksi kilobaasi (kb) vastaa 1000 emäsparia. Moolisuhde kertoo, kuinka monta inserttimolekyyliä kutakin yhtä vektorimolekyyliä kohti tulisi olla. Se ei ole massasuhde.

Miksi käytetään moolisuhdetta eikä massaa

DNA:n yhtä suuret massat eivät sisällä yhtä suurta määrää molekyylejä. Lyhyt insertti painaa vähemmän kuin pitkä vektori, jos molekyylien määrä on sama. Jos lyhyt insertti ja pitkä vektori sekoitettaisiin yhtä suurina nanogrammamäärinä, inserttimolekyylejä olisi vektoriin verrattuna aivan liian vähän. Laskuri suhteuttaa insertin massan fragmenttien pituuksien suhteeseen, jotta lopullisessa seoksessa on tavoiteltu määrä inserttimolekyylejä yhtä vektori­molekyyliä kohti.

DNA-ligaation kaava

Tarvittava insertti-DNA:n määrä nanogrammoina on:

$m_i = m_v \times \frac{k_i}{k_v} \times R$

jossa $m_i$ on insertin määrä nanogrammoina, $m_v$ vektorin määrä nanogrammoina, $k_i$ insertin pituus kilobaaseina, $k_v$ vektorin pituus kilobaaseina ja R insertin ja vektorin välinen tavoitemoolisuhde.

Kun tämä määrä tunnetaan, laskuri muuntaa kunkin määrän pipetoitavaksi tilavuudeksi:

$V_v = \frac{m_v}{c_v}$

$V_i = \frac{m_i}{c_i}$

$V_b = V_t - V_v - V_i$

jossa $V_v$ ja $V_i$ ovat vektorin ja insertin tilavuudet mikrolitroina, $c_v$ ja $c_i$ ovat vektorin ja insertin konsentraatiot nanogrammoina mikrolitraa kohti, $V_b$ on puskurin tilavuus ja $V_t$ reaktion kokonaistilavuus.

Jos vektorin ja insertin yhteenlaskettu tilavuus on suurempi kuin reaktion kokonaistilavuus, puskurille, ligaasille tai vedelle ei jää tilaa. Tällöin laskuri ilmoittaa kokonaistilavuuden olevan liian pieni sen sijaan, että se näyttäisi puskurin määrän negatiivisena.

Ratkaistu esimerkki

Tutkija kloonaa 1 kb:n geenifragmentin 3 kb:n plasmidivektoriin. Tarkoituksena on käyttää 50 ng vektori-DNA:ta insertin ja vektorin välisellä 3:1 moolisuhteella 20 μL:n reaktiossa.

Syöttötiedot:

• Vektorin konsentraatio: 50 ng/μL
• Vektorin pituus: 3000 bp (3 kb)
• Insertin konsentraatio: 25 ng/μL
• Insertin pituus: 1000 bp (1 kb)
• Moolisuhde: 3
• Kokonaistilavuus: 20 μL
• Vektorin määrä: 50 ng

Vaihe 1: insertin määrä

Insertin määrä nanogrammoina = 50 × (1 ÷ 3) × 3 = 50 ng

Vaihe 2: tilavuudet

Vektorin tilavuus = 50 ng ÷ 50 ng/μL = 1 μL

Insertin tilavuus = 50 ng ÷ 25 ng/μL = 2 μL

Puskurin tilavuus = 20 − 1 − 2 = 17 μL

Reaktio koostuu 1 μL:sta vektoria, 2 μL:sta inserttiä ja 17 μL:sta puskuria tai vettä; tähän lisätään myös ligaasi ja sen reaktiopuskuri. Tässä seoksessa on kolme inserttimolekyyliä kutakin vektori­molekyyliä kohti.

Ligaation tyypilliset moolisuhteet

Useimmissa tavanomaisissa kloonauksissa, joissa on tahmeat eli ulkonevat päät, insertin ja vektorin suhde on 3:1. Tylppiä päitä yhdistävät ligaatiot ovat tehottomampia, joten suurempi suhde, kuten 5:1, on tavallinen. Hyvin suuret insertit toimivat joskus paremmin pienemmällä suhteella, joka on lähempänä arvoa 1:1, koska suuret fragmentit sisältävät jo valmiiksi paljon emäspareja molekyyliä kohti.

Usein kysyttyä

Mitä DNA-ligaatio on?

DNA-ligaatio on kahden DNA-fragmentin, yleensä plasmidivektorin ja insertin, yhdistäminen yhdeksi yhtenäiseksi molekyyliksi. T4-DNA-ligaasientsyymi yhdistää fragmenttien päät toisiinsa.

Mitä insertin ja vektorin välinen moolisuhde tarkoittaa?

Se tarkoittaa, kuinka monta insertti-DNA:n molekyyliä reaktiossa on yhtä vektori­molekyyliä kohti. Suhde 3:1 tarkoittaa kolmea inserttimolekyyliä kutakin vektori­molekyyliä kohti riippumatta niiden massojen suhteesta.

Miksi vektoria ja inserttiä ei käytetä yhtä suurina nanogrammamäärinä?

Eri pituisten DNA-fragmenttien massa molekyyliä kohti on erilainen. 1 kb:n insertti painaa molekyyliä kohti noin kolmasosan 3 kb:n vektorin massasta. Jos kumpaakin käytettäisiin yhtä suurina nanogrammamäärinä, molekyylien määrä ei olisi sama, joten laskuri säätää insertin massan vastaamaan tavoitemoolisuhdetta.

Mitä tarkoittaa, jos kokonaistilavuus on liian pieni?

Se tarkoittaa, että pelkät vektorin ja insertin tilavuudet täyttävät jo koko reaktiotilavuuden, joten puskurille tai ligaasille ei jää tilaa. Ratkaisu on kasvattaa reaktion kokonaistilavuutta tai käyttää konsentroituneempia DNA-varastoja.

Voiko tätä laskuria käyttää Gibson Assembly- tai Golden Gate -kloonaukseen?

Ei. Näissä menetelmissä käytetään erilaista reaktiokemiaa, ja niissä pyritään yleensä kaikkien fragmenttien ekvimolaarisiin määriin kiinteän insertin ja vektorin välisen suhteen sijaan. Niiden tilavuuslaskelmat poikkeavat tavanomaisessa T4-DNA-ligaasilla tehtävässä kloonauksessa käytettävistä laskelmista.

Kuinka paljon vektori-DNA:ta yleensä käytetään?

50 ng on tavallinen lähtömäärä tavanomaisessa ligaatioreaktiossa. Laboratorioissa käytetään myös määriä 25–100 ng, joita säädetään DNA:n konsentraation ja reaktion mittakaavan mukaan.