Proteiinin molekyylipainolaskuri | Ilmainen MW-työkalu

Proteiinin molekyylipainolaskuri

Proteiinin molekyylipainolaskuri määrittää proteiinin massan sen aminohapposekvenssin perusteella. Tulos ilmoitetaan daltonina (Da), joka on molekyylimassan vakiomitta. Yksi dalton on lähellä yhden vetyatomin massaa.

Molekyylipainolla on merkitystä laboratorion päivittäisessä työssä. Sen avulla tutkija voi valita SDS-PAGE-geelin akryyliamidipitoisuuden, valita geelisuodatukseen sopivan kolonnin ja tarkistaa, vastaako massaspektrometrian tulos odotettua proteiinia. Laskurin antama arvo on pelkästään sekvenssiin perustuva teoreettinen paino. Todellisten proteiinien massa voi olla suurempi, koska niihin voi proteiinin synteesin jälkeen liittyä kemiallisia ryhmiä eli translaationjälkeisiä muokkauksia. Ne vaihtelevat yksittäisen fosfaattiryhmän muutamasta daltonista raskaiden sokeriketjujen kymmeniin tuhansiin daltoniin.

Proteiinin molekyylipainon laskeminen

Kaava

$MW_{protein} = \sum_{i=1}^{n} MW_{residue_i} + MW_{water}$

Ketjun jokainen aminohappo lisää siihen jäännöksen massan, ei vapaan aminohapon massaa. Kun kaksi aminohappoa liittyy peptidisidoksella, reaktiossa vapautuu yksi vesimolekyyli. Jäännösten massoista tämä vesi on jo poistettu, joten sekvenssin summa ottaa automaattisesti huomioon kaikki ketjun sisäiset peptidisidokset.

Kun jäännösten massat on laskettu yhteen, lisätään yksi vesimolekyyli (18,010565 Da). Tämä vastaa ketjun kahta vapaata päätä: vetyatomia alussa (N-terminus) ja hydroksyyliryhmää lopussa (C-terminus).

Yleinen virhe on vähentää vettä jokaisesta peptidisidoksesta ja lisätä sen jälkeen vielä erikseen yksi vesimolekyyli. Tällöin veden menetys lasketaan kahteen kertaan, koska alla olevista jäännösten massoista se on jo vähennetty. Laskennassa on vain yksi vesitermi, lopussa lisättävä vesimolekyyli.

Aminohappojäännösten massat

Nämä ovat 20 standardiaminohapon monoisotooppiset jäännösmassat daltoneina:

| Aminohappo | | Koodi | | Jäännöksen massa (Da) | | |---|---|---| | Alaniini | A | 71,03711 | | Arginiini | R | 156,10111 | | Asparagiini | N | 114,04293 | | Aspartiinihappo | D | 115,02694 | | Kysteiini | C | 103,00919 | | Glutamiinihappo | E | 129,04259 | | Glutamiini | Q | 128,05858 | | Glysiini | G | 57,02146 | | Histidiini | H | 137,05891 | | Isoleusiini | I | 113,08406 | | Leusiini | L | 113,08406 | | Lysiini | K | 128,09496 | | Metioniini | M | 131,04049 | | Fenyylialaniini | F | 147,06841 | | Proliini | P | 97,05276 | | Seriini | S | 87,03203 | | Treoniini | T | 101,04768 | | Trypofaani | W | 186,07931 | | Tyrosiini | Y | 163,06333 | | Valiini | V | 99,06841 |

Ratkaistu esimerkki

Tarkastellaan lyhyttä ketjua alaniini-glysiini-seriini, joka kirjoitetaan muodossa AGS.

1. Laske jäännösten massat yhteen: 71,03711 + 57,02146 + 87,03203 = 215,0906 Da.
2. Lisää yksi vesimolekyyli ketjun kahta päätä varten: 215,0906 + 18,010565 = 233,101165 Da.
3. Kahden desimaalin tarkkuuteen pyöristettynä AGS:n molekyylipaino on 233,10 Da.

Tämän tripeptidin kahdesta peptidisidoksesta ei vähennetä ylimääräistä vettä. Tämä menetys sisältyy jo vaiheessa 1 käytettyihin kolmen jäännöksen massoihin.

Proteiinin molekyylipainolaskurin käyttö

1. Syötä sekvenssi käyttäen aminohappojen standardinmukaisia yksikirjaimisia koodeja, kuten MVKMDVYKGSSIGDSMSRSM. Sekä isot että pienet kirjaimet toimivat.
2. Laskuri tarkistaa sekvenssin kirjoittamisen aikana ja merkitsee kaikki merkit, jotka eivät kuulu 20 standardikoodiin.
3. Se näyttää molekyylipainon daltonina, sekvenssin pituuden ja aminohappokoostumuksen erittelyn.
4. Tulokset voi kopioida yhdellä napsautuksella laboratoriomuistiinpanoihin tai raportteihin.

Ennen kuin liität sekvenssin esimerkiksi UniProt-tietokannasta, poista FASTA-otsikkorivi (rivi, joka alkaa merkillä >) sekä kohdistusohjelmiston lisäämät sijaintinumerot. Kirjaimet X, B, Z ja J eivät ole aminohappojen standardikoodeja, joten ne hylätään; korvaa ne tietyllä aminohapolla ennen laskemista.

Miksi proteiinin molekyylipainolla on merkitystä

• Geelielektroforeesi (SDS-PAGE): pienet, alle 20 kDa:n proteiinit tarvitsevat hyvään erotteluun suuremman geelipitoisuuden; suuret, yli 100 kDa:n proteiinit pienemmän pitoisuuden.
• Geelisuodatus: proteiinin molekyylipainoalue määrittää, millainen kolonnin hartsi erottaa sen asianmukaisesti.
• Massaspektrometria: laskettua painoa verrataan mitattuun painoon identiteetin varmistamiseksi tai odottamattomien muutosten havaitsemiseksi.
• Peptidisynteesi: molekyylipaino määrittää kussakin kytkentävaiheessa tarvittavan lähtöaineen tarkan määrän.
• Puskurien ja annosten laskeminen: molaarisuuden ja massapitoisuuden välinen muuntaminen edellyttää molekyylipainoa.

Rajoitteet

Laskuri antaa pelkästään sekvenssiin perustuvan teoreettisen painon. Se ei sisällä seuraavia:

• Translaationjälkeiset muokkaukset, kuten glykosylaatiossa lisätyt sokeriketjut tai fosforylaatiossa lisätyt fosfaattiryhmät. Ne on lisättävä manuaalisesti tai määritettävä massaspektrometrialla.
• Disulfidisidokset. Jokainen kahden kysteiinijäännöksen välinen sidos poistaa kaksi vetyatomia, noin 2,02 Da sidosta kohti. Laskuri olettaa, että kaikki kysteiinit ovat sitoutumattomia.
• Epästandardit aminohapot, kuten seleenikysteiini tai pyrrolysiini, sekä kemiallisesti muokatut jäännökset, kuten hydroksiproliini.
• Kofaktorit, kuten hemi-ryhmät tai proteiiniin sitoutuneet metalli-ionit.

Usein kysyttyä

Mikä on proteiinin molekyylipaino? Se on proteiinin kokonaismassa, joka ilmoitetaan yleensä daltonina (Da) tai kilodaltonina (kDa), jolloin 1 kDa vastaa 1 000 Da:ta. Se on sekvenssin aminohappojäännösten massojen summa lisättynä yhdellä vesimolekyylillä ketjun kahta päätä varten.

Miksi kaavaan lisätään vettä eikä vähennetä sitä? Peptidisidoksen muodostuminen vapauttaa vesimolekyylin, ja summassa käytetyistä jäännösten massoista tämä vesi on jo poistettu. Yksi vesimolekyyli lisätään lopuksi takaisin ainoastaan valmiin ketjun päissä olevien vapaiden vety- ja hydroksyyliryhmien huomioon ottamiseksi.

Kuinka tarkka laskettu paino on? Proteiinille, jossa ei ole kemiallisia muokkauksia, laskelma on käytettyjen aminohappomassojen tarkkuuden mukainen, tavallisesti alle yhden daltonin murto-osan tarkkuudella. Todelliset, esimerkiksi glykosyloituneet tai disulfidisidoksia sisältävät proteiinit painavat eri määrän kuin laskettu arvo.

Voiko laskuri käsitellä muokattuja tai epästandardeja aminohappoja? Ei. Se tukee vain 20 standardia aminohappoa. Seleenikysteiiniä, pyrrolysiiniä ja muita muokattuja jäännöksiä ei tunnisteta, vaan ne on käsiteltävä manuaalisella korjauksella tai erikoistyökalulla.

Miten muunnan daltonit kilodaltoneiksi? Jaa luvulla 1 000. Proteiini, jonka massa on 25 000 Da, on 25 kDa. Julkaisuissa pienistä peptideistä käytetään tavallisesti yksikköä Da ja suuremmista proteiineista yksikköä kDa.

Miksi geeli- tai massaspektrometriatulokseni ei vastaa laskettua painoa? Yleisimmät syyt ovat translaationjälkeiset muokkaukset, disulfidisidokset tai se, että proteiinista on translaation jälkeen muodostunut pilkkoutumisen seurauksena lyhyempi kypsä muoto. Yksi syy voi olla myös massatyypin yhteensopimattomuus. Tämä laskuri ilmoittaa monoisotooppisen massan, jossa käytetään kunkin atomin kevyintä isotooppia. Monet muut työkalut, kuten ExPASy ProtParam, ilmoittavat sen sijaan keskimääräisen massan. Keskimääräinen massa on suurempi: lyhyellä peptidillä alle 1 Da ja suurella proteiinilla kymmeniä daltonia. SDS-PAGE voi myös näyttää hyvin happamille tai hyvin emäksisille proteiineille harhaanjohtavan vyöhykkeen sijainnin, joten se on vain karkea arvio molekyylipainosta.