qPCR-tehokkuuslaskuri: Standardikäyrän analyysityökalu

qPCR-tehokkuuslaskuri

qPCR-tehokkuuslaskuri arvioi, kuinka hyvin kvantitatiivinen PCR-reaktio (qPCR) kopioi kohde-DNA-sekvenssiä jokaisella amplifikaatiosyklillä. Se käyttää laimennossarjasta saatuja Ct-arvoja (syklin numero, jossa fluoresenssisignaali ylittää asetetun kynnysarvon) tehokkuuden, kulmakertoimen, vakiotermin ja R²:n laskemiseen.

Mitä qPCR-tehokkuus tarkoittaa?

Kvantitatiivinen PCR seuraa fluoresenssia, kun reaktio kopioi kohde-DNA-sekvenssiä sykli sykliltä. Amplifikaatiotehokkuus kuvaa, kuinka paljon kohde-DNA:n määrä kasvaa kullakin syklillä. Kun tehokkuus on 100 %, kohde-DNA:n määrä kaksinkertaistuu jokaisella syklillä.

Todellisissa reaktioissa ei yleensä saavuteta täsmälleen 100 %:n tehokkuutta. Useimmat laboratoriot pitävät 90 %–110 %:n tehokkuutta hyväksyttävänä luotettavaa kvantifiointia varten. Arvo, joka on alle 90 % tai yli 110 %, viittaa ongelmaan, kuten alukkeiden huonoon suunnitteluun, näytteen eristyksestä peräisin oleviin PCR-estäjiin tai laimennossarjan pipetointivirheisiin.

Tehokkuudella on suurin merkitys, kun geeniekspressiota verrataan näytteiden välillä. Yleinen ΔΔCt-menetelmä muutoksen kertaantumisen laskemiseen olettaa, että jokaisen reaktion tehokkuus on 100 %. Kun mitattu tehokkuus poikkeaa arvosta 100 % tai kun kohdegeenin ja referenssigeenin tehokkuudet eroavat toisistaan, muutoksen kertaantumisen tulokset voivat olla epätarkkoja.

qPCR-tehokkuuden kaava

Tehokkuus lasketaan standardikäyrän kulmakertoimen perusteella. Standardikäyrä muodostetaan esittämällä Ct-arvot laimennossarjan lähtö-DNA:n määrän 10-kantaisen logaritmin (log10) funktiona.

E = 10^(-1/kulmakerroin) - 1

E on tehokkuus desimaalilukuna esitettynä (prosenttiarvo saadaan kertomalla luvulla 100). Kulmakerroin on standardisuoran kulmakerroin. Se on negatiivinen, koska Ct kasvaa lähtö-DNA:n määrän pienentyessä.

Kulmakerroin -3,32 vastaa tehokkuutta 100 %:

10^(-1/-3,32) - 1 = 10^0,301–1 ≈ 1,00

Tämä johtuu siitä, että 10-kertainen laimennos siirtää Ct-arvoa noin 3,32 sykliä, jos reaktiossa DNA:n määrä kaksinkertaistuu jokaisella syklillä, sillä log2(10) on likimäärin 3,32.

Käytännössä kulmakerrointa -3,1–-3,6 pidetään hyväksyttävänä. Tämä alue vastaa noin 90 %–110 %:n tehokkuutta. Arvoa -3,1 lähempänä oleva kulmakerroin antaa suuremman lasketun tehokkuuden; arvoa -3,6 lähempänä oleva kulmakerroin antaa pienemmän tehokkuuden.

qPCR-tehokkuuden laskeminen: standardisuoran menetelmä

1. Valmista laimennossarja. Aloita väkevimmästä näytteestä ja laimenna sitä vakiokertoimella, yleensä 10-kertaisesti, jokaisen seuraavan näytteen kohdalla. Suorita qPCR jokaiselle laimennokselle ja kirjaa sen Ct-arvo.
2. Muunna jokainen laimennos log10-arvoksi. Kun ensimmäinen eli väkevin näyte merkitään sijaksi 0, näytteen numero i suhteellisen määrän log10-arvona on -i × log10(laimennoskerroin).
3. Piirrä Ct-arvo (pystyakseli) jokaisen laimennoksen log10-arvoa (vaaka-akseli) vastaan ja suorita lineaarinen regressio.
4. Lue regressiosuoralta kulmakerroin, vakiotermi ja R².
5. Sijoita kulmakerroin kaavaan E = 10^(-1/kulmakerroin) - 1 tehokkuuden saamiseksi.

Standardisuoran laadun kriteerit

• R² vähintään 0,98. Tämä mittaa, kuinka hyvin pisteet sopivat suoralle. Pienempi arvo viittaa usein pipetointivirheisiin tai epäyhtenäiseen amplifikaatioon.
• Kulmakerroin välillä -3,1–-3,6. Tämä alue vastaa 90–110%:n tehokkuutta.
• Vähintään kolme laimennospistettä. Viisi tai kuusi pistettä tuottaa luotettavamman suoran ja helpottaa poikkeavan havainnon tunnistamista.
• Väkevimmän näytteen Ct-arvon tulisi olla noin 15-20. Laimeimman näytteen Ct-arvon tulisi pysyä alle arvon 35, koska sitä suuremmat arvot lähestyvät määritysrajaa.

Laskuesimerkki

Viiden pisteen 10-kertainen laimennossarja antaa seuraavat Ct-arvot väkevimmästä laimeimpaan: 15,0, 18,5, 22,0, 25,5, 29,0.

Suhteellisen määrän log10-arvot ovat 0, -1, -2, -3, -4, koska jokainen laimennosvaihe lisää arvon -log10(10) eli -1. Ct kasvaa jokaisessa vaiheessa 3,5 sykliä, joten pisteet asettuvat suoralle ja lineaarinen regressio antaa seuraavat tulokset:

• Kulmakerroin: -3,5
• Vakiotermi: 15,0
• R²: 1,0

Tehokkuus: E = 10^(-1/-3,5) - 1 = 10^0,286–1 ≈ 0,931 eli noin 93 %.

Tehokkuus 93 % ja R² = 1,0 täyttävät standardin laatukriteerit ja soveltuvat geeniekspression kvantifiointiin.

Koodiesimerkki

Tämä JavaScript-funktio käyttää samaa menetelmää kuin laskuri. Jokaisen Ct-arvon indeksi negatoidaan ennen logaritmin ottamista, koska ensimmäisellä, väkevimmällä näytteellä on suurin suhteellinen määrä ja jokainen myöhempi näyte on laimeampi.

1function qpcrEfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
2  // Sample 0 is most concentrated; each later sample is diluted further,
3  // so its log10(relative quantity) is negative.
4  const x = ctValues.map((_, i) => -i * Math.log10(dilutionFactor));
5  const n = ctValues.length;
6  let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0;
7  for (let i = 0; i < n; i++) {
8    sumX += x[i];
9    sumY += ctValues[i];
10    sumXY += x[i] * ctValues[i];
11    sumXX += x[i] * x[i];
12  }
13  const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
14  const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
15  const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
16  return { efficiency, slope, intercept };
17}
18
19qpcrEfficiency([15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0], 10);
20// => { efficiency: 93.07, slope: -3.5, intercept: 15 }
21

Miksi tehokkuudella on merkitystä geeniekspressiossa

Muutoksen kertaantumisen laskelmat, kuten ΔΔCt-menetelmä, olettavat, että jokainen reaktio kaksinkertaistaa kohdemääränsä kullakin syklillä. Kun kohdegeenin ja referenssigeenin mitatut tehokkuudet eroavat toisistaan, tavallinen ΔΔCt-kaava aiheuttaa virhettä. Tutkijat siirtyvät usein tehokkuuskorjattuun laskentaan, kuten Michael Pfafflin 2001 kuvaamaan menetelmään, kun tehokkuudet eroavat toisistaan yli noin viisi prosenttiyksikköä. MIQE-ohjeet, vuonna 2009 julkaistu laajasti siteerattu qPCR:n raportointistandardien kokonaisuus, suosittelevat, että tutkimuksissa raportoidaan laskettu tehokkuus, kulmakerroin ja R² yhdessä kvantifiointitulosten kanssa.

Usein kysyttyä

Mikä on hyvä qPCR-tehokkuus prosentteina?

Yleisesti hyväksyttävä alue on 90 %–110 %, ja hyvin optimoiduissa määrityksissä arvo on noin 95–105%. Kulmakerroin -3,32 vastaa täsmälleen tehokkuutta 100 %.

Miksi qPCR-tehokkuuteni on yli 110 %?

Yleisiä syitä ovat laimennossarjan pipetointivirheet, alukedimeerit, väkeviin ja laimeisiin näytteisiin eri tavoin vaikuttavat estäjät tai amplifikaation eksponentiaalisen vaiheen ulkopuolelle asetettu fluoresenssin kynnysarvo. Useita huippuja sisältävä sulamiskäyrä voi viitata alukedimeerien muodostumiseen.

Miksi qPCR-tehokkuuteni on alle 90 %?

Todennäköisiä syitä ovat alukkeiden huono suunnittelu, näytteen eristyksestä peräisin olevat PCR-estäjät tai epäsopiva alukkeiden sitoutumislämpötila. Alukkeiden spesifisyyden tarkistaminen ja lämpötilagradientin käyttäminen voivat auttaa syyn selvittämisessä.

Mitä pieni R²-arvo tarkoittaa?

R² mittaa, kuinka hyvin Ct-arvot sopivat suoralle logaritmisen määrän funktiona. Arvo alle 0,98 viittaa pipetoinnin epäyhtenäisyyteen, estyneeseen näytteeseen tai määritysrajan lähellä olevaan laimennospisteeseen.

Kuinka monta laimennospistettä standardisuora tarvitsee?

Vähintään kolme, mikä on lineaariseen regressioon tarvittava vähimmäismäärä. Viisi tai kuusi pistettä antaa luotettavamman kulmakertoimen ja helpottaa poikkeavien havaintojen tunnistamista.

Voiko tehokkuus muuttua kokeiden välillä?

Kyllä. Uusi reagenssierä, uusi aluke-erä, erityyppinen näyte tai erilainen qPCR-laite voi muuttaa tehokkuutta. Monet laboratoriot tarkistavat tehokkuuden uudelleen muutaman kuukauden välein tai jokaisen uuden reagenssierän yhteydessä.

Viitteet

1. Bustin SA, Benes V, Garson JA ym. MIQE-ohjeet: kvantitatiivisten reaaliaikais-PCR-kokeiden julkaisemiseen tarvittavat vähimmäistiedot. Clinical Chemistry. 2009;55(4):611-622.
2. Pfaffl MW. Uusi matemaattinen malli suhteelliseen kvantifiointiin reaaliaikaisessa RT-PCR:ssä. Nucleic Acids Research. 2001;29(9):e45.
3. Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. Kuinka hyvä PCR-tehokkuusarvio on: Suosituksia täsmällisiin ja luotettaviin qPCR-tehokkuuden arviointeihin. Biomolecular Detection and Quantification. 2015;3:9-16.