מחשבון מסיסות חלבון - כלי חינמי של pH וטמפרטורה

מחשבון מסיסות חלבונים מעריך את הריכוז הגבוה ביותר של חלבון שנשאר מומס בממס בתנאי pH, טמפרטורה ועוצמה יונית נתונים. הוא ממיר כימיה בסיסית למספר יחיד, במיליגרמים של חלבון למיליליטר ממס.

למסיסות חלבונים יש חשיבות בביוכימיה, בניסוח תרופות ובמדעי המזון. חלבון שאינו נשאר מומס יוצר אגרגטים או משקעים, העלולים להרוס ניסוי או להפוך תרופה לבלתי ניתנת להזרקה.

כיצד לחשב מסיסות חלבונים

המסיסות תלויה בחמישה גורמים: הנקודה האיזואלקטרית של החלבון (ה-pH שבו המטען הכולל שלו הוא אפס), טמפרטורת ההתכה שלו (הטמפרטורה שבה הוא מתחיל לעבור פרישה), הקבוע הדיאלקטרי של הממס (מדד ליעילות שבה הוא מפריד חלקיקים טעונים), ה-pH של התמיסה והעוצמה היונית (מדד לכמות המלח המומס).

המחשבון מתחיל מהמסיסות הידועה של כל חלבון במים בתנאי ייחוס: 25 °C, pH 7.0 ועוצמה יונית של 0.15 M (בקירוב, רמת המלח בדם). לאחר מכן הוא מכפיל את ערך הייחוס בארבעה יחסים, אחד עבור כל תנאי שהשתנה.

נוסחת מסיסות חלבונים

$S = S_{ref} \times \frac{f_{pH}(pH)}{f_{pH}(7.0)} \times \frac{f_{ionic}(I)}{f_{ionic}(0.15)} \times \frac{f_{temp}(T)}{f_{temp}(25)} \times f_{solvent}(\varepsilon)$

• $S_{ref}$ היא המסיסות הידועה של החלבון במים בתנאי הייחוס, במ״ג/מ״ל.
• $f_{pH}(pH) = 1 + 9\left(1 - e^{-|pH - pI|}\right)$, כאשר $pI$ היא הנקודה האיזואלקטרית של החלבון. המסיסות נמוכה ביותר בנקודה האיזואלקטרית ועולה ככל שה-pH מתרחק ממנה, עד להתייצבות בתוך כשתי יחידות pH.
• $f_{ionic}(I) = 10^{\left(\frac{0.8\sqrt{I}}{1 + 1.5\sqrt{I}} - I\right)}$, כאשר $I$ היא העוצמה היונית במולים לליטר. ברמות מלח נמוכות מונח זה מעלה מעט את המסיסות («המלחה פנימה»). ברמות מלח גבוהות הוא מוריד את המסיסות («המלחה החוצה»).
• $f_{temp}(T) = e^{0.01(T-25)} \times \dfrac{1}{1 + e^{(T - T_m)/3}}$, כאשר $T_m$ היא נקודת ההתכה של החלבון במעלות צלזיוס. המסיסות עולה בהדרגה עם הטמפרטורה, ולאחר מכן יורדת בחדות כשהטמפרטורה מתקרבת ל-$T_m$ והחלבון מתחיל להיפרש.
• $f_{solvent}(\varepsilon) = 10^{-2000\left(\frac{1}{\varepsilon^2} - \frac{1}{78.4^2}\right)}$, כאשר $\varepsilon$ הוא הקבוע הדיאלקטרי של הממס. למים קבוע דיאלקטרי של 78.4, ולכן מונח זה שווה ל-1 במים. ממסים שמפרידים מטענים ביעילות פחותה ממים, כגון אתנול, מורידים את המסיסות.

ערכי הייחוס שבהם משתמש המחשבון

קטגוריות מסיסות

דוגמה: אלבומין בבופר פוספט

מצאו את המסיסות של אלבומין בבופר פוספט ב-25 °C, pH 7.4 ובעוצמה יונית של 0.15 M.

ערכי הייחוס של אלבומין הם $pI = 4.7$, $S_{ref} = 500$ מ״ג/מ״ל ו-$T_m = 63°C$. לבופר פוספט קבוע דיאלקטרי של 76.0.

1. מונח ה-pH: $f_{pH}(7.4) = 1 + 9(1 - e^{-2.7}) = 9.3952$. $f_{pH}(7.0) = 1 + 9(1 - e^{-2.3}) = 9.0977$. יחס: $9.3952 / 9.0977 = 1.0327$.
2. מונח יוני: העוצמה היונית (0.15 M) שווה לערך הייחוס, ולכן היחס הוא 1.
3. מונח טמפרטורה: הטמפרטורה (25 °C) שווה לערך הייחוס, ולכן היחס הוא 1.
4. מונח ממס: $f_{solvent}(76.0) = 10^{-2000(1/76.0^2 - 1/78.4^2)} = 0.9531$.

$S = 500 \times 1.0327 \times 1 \times 1 \times 0.9531 \approx 492.12\text{ מ״ג/מ״ל}$

המחשבון מדווח על 492.12 mg/מ״ל, ערך הנכלל בקטגוריית «מסיס מאוד».

דוגמה: ליזוזים בגליצרול בטמפרטורה נמוכה

מצאו את המסיסות של ליזוזים בתמיסת גליצרול ב-4 °C, pH 5.0 ובעוצמה יונית של 0.1 M. אלה תנאים הדומים לאחסון קר של אנזים.

ערכי הייחוס של ליזוזים הם $pI = 11.35$, $S_{ref} = 250$ מ״ג/מ״ל ו-$T_m = 72°C$. לגליצרול קבוע דיאלקטרי של 42.5.

1. מונח ה-pH: המעבר מ-pH 7.0 ל-pH 5.0 (שניהם נמוכים בהרבה מה-pI של 11.35) משנה את מונח ה-pH במעט בלבד. יחס: $9.9843 / 9.8838 = 1.0102$.
2. מונח יוני: הורדת העוצמה היונית מ-0.15 M ל-0.1 M מעלה מעט את המסיסות באמצעות אפקט ההמלחה פנימה. יחס: $1.1793 / 1.1117 = 1.0607$.
3. מונח הטמפרטורה: קירור מ־25 °C ל־4 °C, הרבה מתחת לנקודת ההתכה, מפחית את המונח. יחס: 0.8106.
4. מונח ממס: $f_{solvent}(42.5) = 10^{-2000(1/42.5^2 - 1/78.4^2)} = 0.1652$.

$S = 250 \times 1.0102 \times 1.0607 \times 0.8106 \times 0.1652 \approx 35.88\text{ מ״ג/מ״ל}$

המחשבון מדווח על 35.88 mg/מ״ל, ערך הנכלל בקטגוריית «מסיס». הקבוע הדיאלקטרי הנמוך של הגליצרול, ולא הטמפרטורה הנמוכה, הוא שמוריד את התוצאה מערך הייחוס.

כיצד להשתמש במחשבון מסיסות החלבונים

1. בחרו חלבון מהרשימה: אלבומין, אינסולין, ליזוזים, המוגלובין, מיוגלובין, קולגן, קזאין או פיברינוגן.
2. בחרו ממס: מים, בופר פוספט, בופר טריס, גליצרול, DMSO, מתנול, אתנול או אצטון.
3. הזינו את הטמפרטורה ב-°C (0 עד 100), את ה-pH (0 עד 14) ואת העוצמה היונית במולר (0 עד 2).
4. קראו את המסיסות המחושבת במ״ג/מ״ל ואת הקטגוריה שלה. פס מתחת לתוצאה מציג את הערך בסולם של 0 עד 100 mg/מ״ל, ומתמלא במלואו ב-100 mg/מ״ל או יותר.

מה משפיע על מסיסות חלבונים

pH והנקודה האיזואלקטרית. לכל חלבון יש נקודה איזואלקטרית, ה-pH שבו אין למשטח שלו מטען חשמלי כולל. ב-pH זה אין דחייה הדדית בין מולקולות החלבון, ולכן הן מתקבצות ונפרדות מהתמיסה ביתר קלות. שינוי ה-pH הרחק מהנקודה האיזואלקטרית, בכל אחד מהכיוונים, מקנה לחלבון מטען כולל. מולקולות טעונות דוחות זו את זו, וכך נשארות נפרדות ומומסות.

עוצמה יונית. יוני מלח מומסים מקיפים את הקבוצות הטעונות שעל פני החלבון. בריכוזים נמוכים עד בינוניים, יונים אלה מסככים מטענים שאחרת היו מושכים שתי מולקולות חלבון זו אל זו, ובכך מגדילים את המסיסות. תופעה זו נקראת המלחה פנימה. בריכוזי מלח גבוהים, היונים מתחרים בחלבון על מולקולות מים ומסירים את שכבת המים ששומרת על החלבון מומס. תופעה זו נקראת המלחה החוצה, והיא הבסיס לשיטת טיהור נפוצה המשתמשת באמוניום סולפט כדי לשקע חלבונים מתערובת.

טמפרטורה. חימום תמיסה בדרך כלל מגדיל את המסיסות, עד לנקודה מסוימת. כשהטמפרטורה מתקרבת לנקודת ההתכה של חלבון, החלבון מתחיל להיפרש. ההיפרשות חושפת מקטעים הידרופוביים (דוחי מים) של החלבון, שבדרך כלל מוסתרים בתוך המבנה המקופל שלו. המקטעים החשופים נדבקים זה לזה וגורמים לאגרגציה, ולכן המסיסות יורדת בחדות בקרבת נקודת ההתכה ומעליה.

ממס. הקבוע הדיאלקטרי של ממס מודד את יעילותו בהחלשת המשיכה החשמלית בין חלקיקים טעונים. למים קבוע דיאלקטרי גבוה והם מפרידים מטענים היטב, ולכן רוב החלבונים מתמוססים טוב יותר במים מאשר בממסים אורגניים כגון אתנול או אצטון. ממסים בעלי קבוע דיאלקטרי נמוך מאפשרים למטענים מנוגדים שעל מולקולות חלבון שונות למשוך זה את זה בעוצמה רבה יותר, ובכך מעודדים אגרגציה.

מגבלות

המחשבון משתמש במודל מפושט המבוסס על קבוצה קטנה של חלבוני ייחוס וממסים תקניים. הוא אינו מביא בחשבון את טוהר החלבון, תוספים כגון דטרגנטים או מייצבים, או מרכיבי בופר חריגים. התוצאות הן אומדנים לתכנון ניסויים, ולא תחליף למדידה ישירה של המסיסות במעבדה.

שאלות נפוצות

מהי מסיסות חלבונים? מסיסות חלבונים היא הריכוז המרבי של חלבון שנשאר מומס לחלוטין בממס, בלי ליצור אגרגטים או משקע נראים לעין.

מדוע המסיסות של חלבון נמוכה ביותר בנקודה האיזואלקטרית שלו? בנקודה האיזואלקטרית אין לחלבון מטען חשמלי כולל, ולכן מולקולות החלבון אינן דוחות עוד זו את זו מבחינה חשמלית. ללא דחייה זו, גדל הסיכוי שהן ייצמדו זו לזו וייפרדו מהתמיסה.

מה ההבדל בין הגברת המסיסות באמצעות מלח להפחתת המסיסות באמצעות מלח? המלחה פנימה מתרחשת בריכוזי מלח נמוכים, שבהם יונים מומסים מסככים את הקבוצות הטעונות של החלבון זו מזו ומגדילים את המסיסות. המלחה החוצה מתרחשת בריכוזי מלח גבוהים, שבהם היונים מסירים מים מפני השטח של החלבון ומקטינים את המסיסות.

האם טמפרטורה גבוהה יותר תמיד מגדילה את המסיסות? לא. המסיסות נוטה לעלות עם הטמפרטורה רק עד לנקודה מסוימת. כשהטמפרטורה מתקרבת לנקודת ההתכה של חלבון, החלבון מתחיל להיפרש, ובדרך כלל הדבר גורם לאגרגציה ולירידה חדה במסיסות.

מדוע חלבונים מתמוססים פחות באתנול או באצטון מאשר במים? למים קבוע דיאלקטרי גבוה, כלומר הם מחלישים ביעילות רבה את המשיכה החשמלית בין חלקים טעונים של מולקולות חלבון. לאתנול ולאצטון קבועים דיאלקטריים נמוכים יותר, ולכן קבוצות טעונות שעל מולקולות חלבון שונות נמשכות זו לזו בעוצמה רבה יותר בממסים אלה, וההצטברות נעשית סבירה יותר.

עד כמה המחשבון מדויק? הוא מספק אומדן המבוסס על מודל פיזיקלי ועל קבוצה קטנה של חלבוני ייחוס וממסים. הוא שימושי לצמצום התנאים שכדאי לבדוק, אך מדידה ניסויית היא עדיין הדרך היחידה לאשר את המסיסות של דגימת חלבון מסוימת.

לקריאה נוספת

• Arakawa, T., & Timasheff, S. N. (1984). מנגנון ההמלחה פנימה וההמלחה החוצה של חלבונים באמצעות מלחי קטיונים דו-ערכיים. Biochemistry, 23(25), 5912–5923.
• Trevino, S. R., Scholtz, J. M., & Pace, C. N. (2008). מדידה והגדלה של מסיסות חלבונים. Journal of Pharmaceutical Sciences, 97(10), 4155–4166.
• Cohn, E. J., & Edsall, J. T. (1943). Proteins, Amino Acids and Peptides as Ions and Dipolar Ions. Reinhold Publishing.