Kalkulator razrjeđivanja stanica

Kalkulator razrjeđivanja stanica izračunava koliko suspenzije stanica i koliko razrjeđivača treba pomiješati da bi se u odabranom konačnom volumenu postigla ciljana koncentracija stanica. Upotrebljava se u staničnoj kulturi, mikrobiologiji i drugim laboratorijskim postupcima u kojima se uzorak prije uporabe mora dovesti na točno određenu koncentraciju.

Što znači razrjeđivanje stanica

Razrjeđivanjem suspenzije stanica ne mijenja se broj stanica koje ona sadržava. Mijenja se samo volumen u kojem se stanice nalaze, čime se smanjuje koncentracija. Suspenzija izmjerena kao 1.000.000 stanica po mililitru (stanica/mL) i nakon razrjeđivanja sadržava isti ukupan broj stanica. Taj je broj samo raspoređen u većoj količini tekućine.

U laboratorijima se stanice razrjeđuju prije mnogih rutinskih postupaka: presađivanja rastuće kulture u nove tikvice, nasađivanja određenog broja stanica u svaku jažicu pločice, zamrzavanja stanica za pohranu ili pripreme uzorka za brojač stanica ili protočni citometar.

Formula za razrjeđivanje stanica

Izračun se temelji na jednom pravilu. Broj stanica uzetih iz početne suspenzije, pomnožen s njihovom koncentracijom, mora biti jednak broju stanica u konačnom volumenu, pomnoženom s ciljnom koncentracijom:

C₁ × V₁ = C₂ × V₂

C₁ — početna koncentracija (koncentracija početne suspenzije), u stanicama/mL
V₁ — volumen početne suspenzije koji treba upotrijebiti, u mL
C₂ — ciljana koncentracija, u stanicama/mL
V₂ — potreban ukupni konačni volumen, u mL

Rješavanjem po V₁ dobiva se volumen početne suspenzije koji treba uzeti pipetom:

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁

Ostatak konačnog volumena čini razrjeđivač, obično medij za staničnu kulturu, fosfatnim puferom puferirana fiziološka otopina (PBS) ili drugi pufer:

Volumen razrjeđivača = V₂ − V₁

Ciljana koncentracija (C₂) nikada ne može biti viša od početne koncentracije (C₁). Razrjeđivanjem se koncentracija samo smanjuje. Za njezino povećanje stanice treba centrifugirati i resuspendirati u manjoj količini tekućine.

Kako izračunati razrjeđivanje stanica

Izbrojite stanice u početnoj suspenziji pomoću hemocitometra ili automatskog brojača stanica kako biste dobili C₁.
Zabilježite ciljanu koncentraciju, C₂, koju zahtijeva protokol.
Odredite potreban ukupni konačni volumen, V₂.
Izračunajte V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁.
Izračunajte volumen razrjeđivača kao V₂ − V₁.
U tubu pipetom prenesite V₁ početne suspenzije, a zatim dodajte volumen razrjeđivača u obliku medija ili pufera.

Primjer izračuna

Početna suspenzija izmjerena je kao 1.000.000 stanica/mL. Protokol zahtijeva 100.000 stanica/mL u konačnom volumenu od 10 mL.

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁ = (100.000 × 10) ÷ 1.000.000 = 1.000.000 ÷ 1.000.000 = 1 mL

Volumen razrjeđivača = V₂ − V₁ = 10 − 1 = 9 mL

Uzimanje 1 mL početne suspenzije i dodavanje 9 mL medija daje 10 mL suspenzije koncentracije 100.000 stanica/mL.

Drugi primjer

Test na pločici s 96 jažica zahtijeva 10.000 stanica po jažici u 200 mikrolitara (μL) medija po jažici. To odgovara ciljanoj koncentraciji od 50.000 stanica/mL jer 10.000 stanica podijeljeno s 0,2 mL iznosi 50.000 stanica/mL. Početna suspenzija izmjerena je kao 2.000.000 stanica/mL, a potrebno je ukupno 20 mL kako bi se pokrila cijela pločica i ostavilo nešto viška zbog gubitka pri pipetiranju.

V₁ = (50.000 × 20) ÷ 2.000.000 = 1.000.000 ÷ 2.000.000 = 0,5 mL

Volumen razrjeđivača = 20 − 0,5 = 19,5 mL

Miješanjem 0,5 mL početne suspenzije s 19,5 mL medija dobiva se 20 mL koncentracije 50.000 stanica/mL, odnosno razrjeđenje 1 prema 40.

Izvori pogrešaka

Sama je formula točna. Pogreške nastaju zbog brojeva unesenih u nju.

Pogreška pri brojanju. Pogrešan broj stanica izravno dovodi do pogrešnog razrjeđenja. Taj se rizik smanjuje brojanjem sva četiri kutna kvadrata mreže hemocitometra i izračunom njihova prosjeka.
Slijepljene stanice. Nakupina stanica pod mikroskopom izgleda kao jedna stanica, ali zapravo ih ima nekoliko, pa se prividna koncentracija smanjuje.
Raspon pipete. Pipeta koja se upotrebljava izvan svojeg nazivnog raspona volumena daje netočne rezultate. Pipeta od 1000 μL podešena za ispuštanje 5 μL nije pouzdana; umjesto nje treba upotrijebiti manju pipetu.
Zamjena mjernih jedinica. Miješanje jedinica stanica/mL i stanica/μL dovodi do pogreške tisuću puta prevelike ili premale.
Mrtve stanice. Izravno brojanje stanica uključuje mrtve stanice ako nije upotrijebljena boja za određivanje vijabilnosti, poput tripanskog modrila. Zbog toga se može precijeniti broj stvarno prisutnih živih stanica.

Ograničenja kalkulatora

Kalkulator odbija brojeve na temelju kojih nije moguće dobiti koristan odgovor:

Svaka vrijednost mora biti veća od nule.
Ciljana koncentracija ne može biti viša od početne koncentracije.
Početna koncentracija mora biti najviše 1 bilijun stanica/mL (1 × 10¹²).
Izračunati volumen početne suspenzije mora iznositi najmanje 0,001 mL, što je 1 mikrolitra. Manji se volumen ne može točno pipetirati, pa kalkulator traži druge vrijednosti. Povećanje ukupnog volumena obično rješava taj problem.

Volumeni se prikazuju s dvije decimale, odnosno s tri kada je volumen početne suspenzije manji od 0,01 mL, tako da se mali volumen nikada ne prikazuje kao 0,00 mL.

Često postavljana pitanja

Koja je formula za razrjeđivanje stanica?

C₁ × V₁ = C₂ × V₂, pri čemu su C₁ i C₂ početna i ciljana koncentracija, a V₁ i V₂ volumen uzet iz početne suspenzije i ukupni konačni volumen.

Može li ciljana koncentracija biti viša od početne koncentracije?

Ne. Razrjeđivanjem se koncentracija samo smanjuje. Za postizanje veće koncentracije stanice treba centrifugirati i resuspendirati u manjem volumenu.

Koju tekućinu treba upotrijebiti za razrjeđivanje stanica?

Potpuni medij za staničnu kulturu upotrebljava se kada stanice moraju ostati zdrave satima ili danima, primjerice prije nasađivanja pločice. PBS ili slična puferirana fiziološka otopina prikladna je za kratka razrjeđivanja, kraća od približno 30 minuta, prije daljnje obrade stanica. Medij bez seruma upotrebljava se kada bi serumski proteini ometali naknadni test.

Vrijedi li ova formula za bakterije ili kvasac?

Da. C₁V₁ = C₂V₂ vrijedi za svaku suspenziju čestica, uključujući bakterije mjerene u jedinicama koje tvore kolonije po mililitru (CFU/mL), kvasac i virusne čestice mjerene u jedinicama koje tvore plakove po mililitru (PFU/mL), pod uvjetom da se na objema stranama jednadžbe upotrebljavaju iste jedinice.

Treba li mrtve stanice uključiti u razrjeđivanje?

Pri nasađivanju žive kulture treba računati samo vijabilne stanice. Ako je suspenzija 80 % vijabilna, njezina vijabilna koncentracija iznosi 0,8 ukupnog broja stanica, a ta se vijabilna koncentracija treba upotrijebiti kao C₁.

Kako se vrlo velika razrjeđenja mogu točno izvesti?

Velika razrjeđenja, poput 1 prema 1000, obično se izvode u nizu manjih koraka koji se nazivaju serijska razrjeđenja. Tri uzastopna razrjeđenja 1 prema 10 daju ukupno razrjeđenje 1 prema 1000, pri čemu svaki korak pipetiranja ostaje unutar točnog raspona volumena.

Kalkulator razrjeđivanja stanica - Precizni laboratorijski alat za razrjeđivanje