Kalkulator koncentracije proteina | A280 do mg/mL

Kalkulator koncentracije proteina

Kalkulator koncentracije proteina pretvara očitanje apsorbancije svjetlosti sa spektrofotometra u količinu proteina otopljenog u otopini. Rezultat se obično navodi u miligramima po mililitru (mg/mL) ili mikrogramima po mililitru (μg/mL). Izračun se temelji na Beer-Lambertovu zakonu, koji u kemiji povezuje količinu svjetlosti koju uzorak apsorbira s količinom tvari koju sadržava.

Kako se mjeri koncentracija proteina

Većina proteina snažno apsorbira ultraljubičasto svjetlo pri valnoj duljini od 280 nanometara (nm). Tu apsorpciju uglavnom uzrokuju dvije aminokiseline, triptofan i tirozin, koje se nalaze u strukturi proteina. Spektrofotometar propušta svjetlost kroz uzorak i mjeri koliko je svjetlosti uzorak apsorbirao. To se očitanje naziva apsorbancija ili A280 kada se mjeri pri 280 nm.

Mjerenje apsorbancije pri 280 nm brzo je i ne uništava uzorak. Po tome se razlikuje od kemijskih metoda kao što su Bradfordov i BCA test, opisani u nastavku. Metoda najbolje funkcionira s pročišćenim proteinom u otopini, čija je apsorbancija između približno 0,1 i 1,0. Očitanja izvan tog raspona manje su pouzdana, pa uzorak prije mjerenja često treba razrijediti.

Formula za koncentraciju proteina

Kalkulator preuređuje Beer-Lambertov zakon kako bi izračunao koncentraciju:

C = (A × DF) / (ε × l)

• C — koncentracija proteina u mg/mL
• A — apsorbancija pri 280 nm (čisti broj, bez mjerne jedinice)
• DF — faktor razrjeđenja, odnosno koliko je puta izvorni uzorak razrijeđen prije mjerenja
• ε — ekstinkcijski koeficijent, konstanta svojstvena određenom proteinu, u L/(g·cm)
• l — duljina optičkog puta, udaljenost koju svjetlost prolazi kroz uzorak, u cm (obično 1 cm u standardnoj kiveti, malom staklenom ili plastičnom spremniku koji se upotrebljava u spektrofotometru)

Za pretvaranje rezultata u mikrograme po mililitru vrijednost u mg/mL pomnožite s 1.000. Za određivanje ukupne mase proteina u uzorku pomnožite koncentraciju s volumenom uzorka u mililitrima.

Primjer s rješenjem

Uzorak ima apsorbanciju 0,5 pri 280 nm. Nije razrijeđen, pa je faktor razrjeđenja 1, a mjeren je u standardnoj kiveti od 1 cm. Protein je goveđi serumski albumin (BSA), koji ima ekstinkcijski koeficijent 0,667 L/(g·cm).

C = (0,5 × 1) / (0,667 × 1) ≈ 0,75 mg/mL

U uzorku od 1 mL to iznosi približno 0,75 mg ukupnog proteina, odnosno 750 μg/mL.

Ekstinkcijski koeficijenti uobičajenih proteina

Svaki protein različito apsorbira svjetlost jer sadrži različit broj ostataka triptofana i tirozina. Ekstinkcijski koeficijent opisuje to svojstvo određenog proteina pri 280 nm, u jedinicama L/(g·cm). Uobičajene vrijednosti uključuju:

Kalkulator može prihvatiti i prilagođeni ekstinkcijski koeficijent za protein koji nije na ovom popisu. Za protein s poznatim slijedom aminokiselina ta se vrijednost može procijeniti formulom koju su Gill i von Hippel objavili 1989: ε₂₈₀ = (ostaci triptofana × 5.500) + (ostaci tirozina × 1.490) + (ostaci cistina × 125). Ta formula daje rezultat u M⁻¹cm⁻¹, molarnoj jedinici koja se razlikuje od prethodno navedenih masenih vrijednosti u L/(g·cm). Besplatni alati poput ProtParama, koji je dostupan na poslužitelju ExPASy, izračunavaju tu vrijednost izravno iz slijeda proteina.

Duljina optičkog puta i faktor razrjeđenja

Duljina optičkog puta jest širina kivete u kojoj se nalazi uzorak, a mjeri se u centimetrima. Standardne kivete široke su 1 cm. Spektrofotometri za mikrovolumene, koji mjere vrlo male uzorke, mogu upotrebljavati mnogo kraći optički put, primjerice 0,1 cm.

Faktor razrjeđenja uzima u obzir svako razrjeđivanje provedeno prije mjerenja. Ako bi koncentrirani uzorak imao apsorbanciju veću od 1,0, uobičajeno ga je najprije razrijediti puferom. Faktor razrjeđenja jednak je omjeru ukupnog volumena nakon razrjeđivanja i izvornog volumena uzorka. Na primjer, miješanjem 10 μL uzorka s 990 μL pufera dobiva se ukupni volumen od 1.000 μL i faktor razrjeđenja 100.

Drugi načini mjerenja koncentracije proteina

Apsorbancija pri 280 nm jedna je od nekoliko uobičajenih metoda koje se upotrebljavaju u laboratoriju.

• Bradfordov test: upotrebljava boju koja mijenja boju kada se veže na protein. Dobro funkcionira s nepročišćenim uzorcima, ali se promjena boje može razlikovati među različitim proteinima.
• BCA test: temelji se na promjeni boje koju uzrokuju peptidne veze u proteinu. Kompatibilan je s mnogim deterdžentima, ali za provedbu treba više vremena nego za izravno mjerenje apsorbancije.
• Lowryjeva metoda: starija je metoda koja je vrlo osjetljiva, ali slabo reagira s nekim uobičajenim sastojcima pufera.

Sve tri metode uništavaju uzorak. Izravno mjerenje A280 to ne čini, pa se isti uzorak može sačuvati i ponovno upotrijebiti.

Često postavljana pitanja

Koji je idealan raspon apsorbancije za ovu metodu?

Između 0,1 i 1,0. Ispod 0,1 očitanje je neprecizno. Iznad 1,0 odnos između apsorbancije i koncentracije možda više nije pravocrtan, pa uzorak najprije treba razrijediti.

Zašto mjeriti pri 280 nm umjesto pri 260 nm?

Nukleinske kiseline, poput DNA i RNA, snažno apsorbiraju pri 260 nm. Proteini više apsorbiraju pri 280 nm zbog sadržaja triptofana i tirozina. Mjerenje pri 280 nm smanjuje utjecaj nukleinskih kiselina prisutnih u uzorku.

Kako se određuje ekstinkcijski koeficijent za protein koji nije na popisu?

Za protein s poznatim slijedom alat poput ProtParama izračunava ga na temelju broja ostataka triptofana, tirozina i cistina. Može se izmjeriti i izravno, usporedbom apsorbancije uzorka s otopinom poznate koncentracije.

Funkcionira li ova metoda za smjesu proteina?

Najbolje funkcionira za jedan pročišćeni protein s poznatim ekstinkcijskim koeficijentom. Smjesa nepoznatih proteina, poput staničnog lizata, obično se umjesto toga mjeri Bradfordovim ili BCA testom jer te metode daju ujednačeniju procjenu ukupne količine proteina.

Mogu li deterdženti utjecati na očitanje?

Da. Mnogi deterdženti apsorbiraju svjetlost u blizini 280 nm, što može izobličiti rezultat. Upotreba slijepe probe koja sadržava istu koncentraciju deterdženta pomaže ukloniti tu pozadinsku apsorbanciju. Vrlo visoke koncentracije deterdženta mogu zahtijevati test kompatibilan s deterdžentima, poput BCA testa.