Kalkulator učinkovitosti qPCR-a: Alat za analizu standardne krivulje

Kalkulator učinkovitosti qPCR-a

Kalkulator učinkovitosti qPCR-a procjenjuje koliko dobro reakcija kvantitativnog PCR-a (qPCR-a) kopira ciljnu sekvencu DNK u svakom ciklusu amplifikacije. Za izračun učinkovitosti, nagiba, odsječka i R² koristi vrijednosti Ct (broj ciklusa u kojem fluorescentni signal prelazi zadani prag) iz serije razrjeđenja.

Što je učinkovitost qPCR-a?

Kvantitativni PCR prati fluorescenciju dok reakcija, ciklus po ciklus, kopira ciljnu sekvencu DNK. Učinkovitost amplifikacije opisuje koliko se količina ciljne DNK povećava u svakom ciklusu. Pri učinkovitosti od 100 % količina ciljne DNK udvostručuje se u svakom ciklusu.

Stvarne reakcije rijetko postižu točno 100 %. Većina laboratorija smatra učinkovitost između 90 % i 110 % prihvatljivom za pouzdanu kvantifikaciju. Vrijednost ispod 90 % ili iznad 110 % upućuje na problem, primjerice loš dizajn početnica, inhibitore PCR-a prenesene ekstrakcijom uzorka ili pogreške pri pipetiranju u seriji razrjeđenja.

Učinkovitost je najvažnija pri usporedbi ekspresije gena između uzoraka. Uobičajena metoda ΔΔCt za izračun promjene ekspresije pretpostavlja da se svaka reakcija odvija uz učinkovitost od 100 %. Kada se izmjerena učinkovitost razlikuje od 100 % ili kada ciljni i referentni gen imaju različite učinkovitosti, rezultati promjene ekspresije mogu biti netočni.

Formula učinkovitosti qPCR-a

Učinkovitost se izračunava iz nagiba standardne krivulje, pravca dobivenog prikazom vrijednosti Ct u odnosu na logaritam s bazom 10 (log10) količine početne DNK u seriji razrjeđenja.

E = 10^(-1/nagib) - 1

E je učinkovitost izražena kao decimalni broj (za postotak se množi s 100). Nagib je nagib pravca standardne krivulje. Negativan je jer Ct raste kako se količina početne DNK smanjuje.

Nagib od -3,32 odgovara učinkovitosti od 100 %:

10^(-1/-3,32) - 1 = 10^0,301–1 ≈ 1,00

To proizlazi iz toga što bi razrjeđenje od 10 puta trebalo pomaknuti Ct za približno 3,32 ciklusa ako reakcija udvostručuje DNK u svakom ciklusu, jer je log2(10) približno 3,32.

U praksi se nagib između -3,1 i -3,6 smatra prihvatljivim. Taj raspon odgovara učinkovitosti od približno 90 % do 110 %. Nagib bliži -3,1 daje višu izračunatu učinkovitost, a nagib bliži -3,6 nižu.

Kako izračunati učinkovitost qPCR-a: metoda standardne krivulje

1. Pripremite seriju razrjeđenja. Počnite s najkoncentriranijim uzorkom i svaki sljedeći uzorak razrijedite fiksnim faktorom, najčešće 10 puta. Provedite qPCR za svako razrjeđenje i zabilježite njegovu vrijednost Ct.
2. Svako razrjeđenje pretvorite u vrijednost log10. Ako se prvi, najkoncentriraniji uzorak označi položajem 0, uzorak broj i ima log10 (relativne količine) jednak -i × log10(faktora razrjeđenja).
3. Za svako razrjeđenje prikažite Ct (okomita os) u odnosu na vrijednost log10 (vodoravna os) i provedite linearnu regresiju.
4. Očitajte nagib, odsječak i R² regresijskog pravca.
5. Uvrstite nagib u E = 10^(-1/nagib) - 1 kako biste dobili učinkovitost.

Kriteriji kvalitete standardne krivulje

• R² od najmanje 0,98. To mjeri koliko dobro se točke uklapaju u pravac. Niža vrijednost često upućuje na pogreške pri pipetiranju ili neujednačenu amplifikaciju.
• Nagib između -3,1 i -3,6. Taj raspon odgovara učinkovitosti od 90–110%.
• Najmanje tri točke razrjeđenja. Pet ili šest točaka daje pouzdaniji pravac i olakšava uočavanje odstupajuće vrijednosti.
• Najkoncentriraniji uzorak trebao bi imati Ct oko 15-20. Najrazrijeđeniji uzorak trebao bi ostati ispod Ct 35 jer se vrijednosti iznad toga približavaju granici detekcije.

Primjer izračuna

Serija razrjeđenja u pet točaka, razrijeđena 10 puta, daje sljedeće vrijednosti Ct, od najkoncentriranije do najrazrijeđenije: 15,0, 18,5, 22,0, 25,5, 29,0.

Vrijednosti log10 (relativne količine) iznose 0, -1, -2, -3, -4 jer svaki korak razrjeđenja dodaje -log10(10), odnosno -1. Ct raste za 3,5 ciklusa pri svakom koraku, pa točke leže na pravcu i linearna regresija daje:

• Nagib: -3,5
• Odsječak: 15,0
• R²: 1,0

Učinkovitost: E = 10^(-1/-3,5) - 1 = 10^0,286–1 ≈ 0,931, odnosno približno 93 %.

Učinkovitost od 93 % uz R² = 1,0 zadovoljava standardne kriterije kvalitete i prikladna je za kvantifikaciju ekspresije gena.

Primjer koda

Ova funkcija u JavaScriptu primjenjuje istu metodu kao kalkulator. Indeks svake vrijednosti Ct negira se prije izračuna logaritma jer prvi, najkoncentriraniji uzorak ima najveću relativnu količinu, a svaki je sljedeći uzorak razrijeđeniji.

1function qpcrEfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
2  // Sample 0 is most concentrated; each later sample is diluted further,
3  // so its log10(relative quantity) is negative.
4  const x = ctValues.map((_, i) => -i * Math.log10(dilutionFactor));
5  const n = ctValues.length;
6  let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0;
7  for (let i = 0; i < n; i++) {
8    sumX += x[i];
9    sumY += ctValues[i];
10    sumXY += x[i] * ctValues[i];
11    sumXX += x[i] * x[i];
12  }
13  const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
14  const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
15  const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
16  return { efficiency, slope, intercept };
17}
18
19qpcrEfficiency([15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0], 10);
20// => { efficiency: 93.07, slope: -3.5, intercept: 15 }
21

Zašto je učinkovitost važna za ekspresiju gena

Izračuni promjene ekspresije, uključujući metodu ΔΔCt, pretpostavljaju da se količina ciljnog proizvoda u svakoj reakciji udvostručuje u svakom ciklusu. Kada ciljni i referentni gen imaju različite izmjerene učinkovitosti, jednostavna formula ΔΔCt uvodi pogrešku. Istraživači često prelaze na izračun s korekcijom učinkovitosti, poput metode koju je Michael Pfaffl opisao 2001, kada se učinkovitosti razlikuju za više od približno pet postotnih bodova. Smjernice MIQE, široko citiran skup standarda za izvještavanje o qPCR-u objavljen 2009, preporučuju da se uz rezultate kvantifikacije navedu izračunata učinkovitost, nagib i R².

Često postavljana pitanja

Koji je dobar postotak učinkovitosti qPCR-a?

Općenito se prihvaća raspon između 90 % i 110 %, a dobro optimizirani testovi postižu oko 95–105%. Nagib od -3,32 odgovara točno 100 %.

Zašto je učinkovitost mog qPCR-a iznad 110 %?

Uobičajeni uzroci uključuju pogreške pri pipetiranju u seriji razrjeđenja, dimere početnica, inhibitore koji nejednako utječu na koncentrirane i razrijeđene uzorke ili fluorescentni prag postavljen izvan eksponencijalne faze amplifikacije. Krivulja taljenja s više od jednog vrha može upućivati na dimere početnica.

Zašto je učinkovitost mog qPCR-a ispod 90 %?

Mogući uzroci uključuju loš dizajn početnica, inhibitore PCR-a zaostale nakon ekstrakcije uzorka ili neoptimalnu temperaturu hibridizacije. Provjera specifičnosti početnica i provedba temperaturnog gradijenta mogu pomoći u otkrivanju uzroka.

Što znači niska vrijednost R²?

R² mjeri koliko se vrijednosti Ct dobro uklapaju u pravac u odnosu na logaritamsku količinu. Vrijednost ispod 0,98 upućuje na neujednačeno pipetiranje, inhibirani uzorak ili točku razrjeđenja blizu granice detekcije.

Koliko je točaka razrjeđenja potrebno za standardnu krivulju?

Najmanje tri, što je minimum potreban za linearnu regresiju. Pet ili šest točaka daje pouzdaniji nagib i olakšava uočavanje odstupajućih vrijednosti.

Može li se učinkovitost mijenjati između eksperimenata?

Da. Nova serija reagensa, nova serija početnica, drugačija vrsta uzorka ili drugi instrument za qPCR mogu promijeniti učinkovitost. Mnogi laboratoriji ponovno provjeravaju učinkovitost svakih nekoliko mjeseci ili pri svakoj novoj seriji reagensa.

Reference

1. Bustin SA, Benes V, Garson JA i dr. Smjernice MIQE: minimalne informacije za objavu eksperimenata kvantitativnog PCR-a u stvarnom vremenu. Clinical Chemistry. 2009;55(4):611-622.
2. Pfaffl MW. Novi matematički model za relativnu kvantifikaciju RT-PCR-a u stvarnom vremenu. Nucleic Acids Research. 2001;29(9):e45.
3. Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. Koliko je dobra procjena učinkovitosti PCR-a: preporuke za preciznu i pouzdanu procjenu učinkovitosti qPCR-a. Biomolecular Detection and Quantification. 2015;3:9-16.