Izračunajte koncentraciju DNA iz očitanja apsorbancije (A260) s prilagodljivim faktorima razrjeđenja. Bitni alat za laboratorije molekularne biologije i genetska istraživanja.
Koncentracija DNA se izračunava pomoću sljedeće formule:
Kalkulator koncentracije DNA je bitan online alat koji pomaže molekularnim biologima, genetičarima i laboratorijskim tehničarima da točno odrede koncentraciju DNA iz spektrofotometrijskih očitanja. Ovaj besplatni kalkulator koristi standardnu A260 metodu za pretvaranje UV apsorpcijskih mjerenja u precizne vrijednosti koncentracije DNA u ng/μL.
Mjerenje koncentracije DNA je temeljna procedura u laboratorijima molekularne biologije, koja služi kao kritična kontrola kvalitete prije PCR-a, sekvenciranja, kloniranja i drugih molekularnih tehnika. Naš kalkulator eliminira ručne proračune i smanjuje pogreške prilikom određivanja i koncentracije i ukupnih količina DNA u vašim uzorcima.
Izračun koncentracije DNA oslanja se na Beer-Lambertov zakon, koji navodi da je apsorpcija otopine izravno proporcionalna koncentraciji apsorbirajuće tvari u otopini i duljini puta svjetlosti kroz otopinu. Za dvostruku spiralu DNA, apsorpcija od 1.0 na 260nm (A260) u cuveti duljine 1cm odgovara koncentraciji od otprilike 50 ng/μL.
Koncentracija DNA izračunava se pomoću sljedeće formule:
Gdje:
Ukupna količina DNA u uzorku može se izračunati pomoću:
Apsorpcija na 260nm (A260):
Faktor konverzije (50):
Faktor razrjeđenja:
Volumen:
Slijedite ovaj jednostavan postupak za izračunavanje koncentracije DNA iz vaših A260 očitanja:
Mjerenje koncentracije DNA je bitno za brojne molekularne biologije i istraživačke primjene:
Prije ligacije DNA fragmenata u vektore, poznavanje točne koncentracije omogućuje istraživačima izračun optimalnog omjera umetanja i vektora, maksimizirajući učinkovitost transformacije. Na primjer, omjer od 3:1 molekula umetanja i vektora često daje najbolje rezultate, što zahtijeva precizna mjerenja koncentracije oba sastojka.
PCR reakcije obično zahtijevaju 1-10 ng uzorka DNA za optimalnu amplifikaciju. Premalo DNA može rezultirati neuspjehom amplifikacije, dok previše može inhibirati reakciju. Za kvantitativni PCR (qPCR), potrebna je još preciznija kvantifikacija DNA kako bi se osigurale točne standardne krivulje i pouzdana kvantifikacija.
Protokoli pripreme NGS biblioteka specificiraju točne količine DNA ulaza, često u rasponu od 1-500 ng, ovisno o platformi i primjeni. Točno mjerenje koncentracije ključno je za uspješnu pripremu biblioteka i uravnoteženu reprezentaciju uzoraka u multiplex sekvenciranju.
Kada se DNA unosi u eukariotske stanice, optimalna količina DNA varira ovisno o tipu stanice i metodi transfezije. Obično se koristi 0.5-5 μg plazmidne DNA po bunaru u formatu 6-bunarske ploče, što zahtijeva precizno mjerenje koncentracije za standardizaciju eksperimenata.
U forenzičkim primjenama, uzorci DNA su često ograničeni i dragocjeni. Točna kvantifikacija omogućuje forenzičarima da odrede je li prisutna dovoljna količina DNA za profiliranje i da standardiziraju količinu DNA korištenu u naknadnim analizama.
Restrikcijski enzimi imaju specifične jedinice aktivnosti definirane po μg DNA. Poznavanje točne koncentracije DNA omogućuje pravilne omjere enzima i DNA, osiguravajući potpunu probavu bez "star" aktivnosti (nespecifičnog rezanja).
Iako je UV spektrofotometrija najčešća metoda za kvantifikaciju DNA, postoje i nekoliko alternativa:
Fluorometrijske metode:
Agarozna gel elektroforeza:
Real-time PCR:
Digital PCR:
Sposobnost točnog mjerenja koncentracije DNA značajno se razvijala zajedno s napretkom u molekularnoj biologiji:
Nakon otkrića strukture DNA od strane Watsona i Cricka 1953. godine, znanstvenici su počeli razvijati metode za izolaciju i kvantifikaciju DNA. Rani pristupi oslanjali su se na kolorimetrijske testove poput reakcije diphenylamine, koja je proizvodila plavu boju kada je reagirala s deoksiriboza šećerima u DNA. Ove metode bile su relativno neosjetljive i sklone smetnjama.
Primjena UV spektrofotometrije za kvantifikaciju nukleinskih kiselina postala je široko rasprostranjena 1970-ih. Znanstvenici su otkrili da DNA apsorbira UV svjetlost s maksimumom na 260nm, a da je odnos između apsorpcije i koncentracije linearni unutar određenog raspona. Faktor konverzije od 50 ng/μL za dvostruku spiralu DNA pri A260 = 1.0 uspostavljen je tijekom ovog razdoblja.
Razvoj fluorescentnih boja specifičnih za DNA u 1980-ima i 1990-ima revolucionirao je kvantifikaciju DNA, posebno za razrijeđene uzorke. Hoechst boje i kasnije PicoGreen omogućile su mnogo osjetljivije detekcije nego što je to bilo moguće sa spektrofotometrijom. Ove metode postale su posebno važne s pojavom PCR-a, koji je često zahtijevao preciznu kvantifikaciju malih količina DNA.
Uvođenje spektrofotometara za mikrovolumene poput NanoDrop-a početkom 2000-ih transformiralo je rutinsku kvantifikaciju DNA zahtijevajući samo 0.5-2 μL uzorka. Ova tehnologija eliminirala je potrebu za razrjeđenjima i cuvetama, čineći proces bržim i praktičnijim.
Danas, napredne tehnike poput digitalnog PCR-a i sekvenciranja nove generacije pomaknule su granice kvantifikacije DNA još dalje, omogućujući apsolutnu kvantifikaciju specifičnih sekvenci i detekciju pojedinačnih molekula. Međutim, osnovni spektrofotometrijski princip uspostavljen prije nekoliko desetljeća ostaje temelj rutinskog mjerenja koncentracije DNA u laboratorijima širom svijeta.
Prođimo kroz nekoliko praktičnih primjera izračuna koncentracije DNA:
Istraživač je pročistio plazmid i dobio sljedeća mjerenja:
Izračun:
Nakon ekstrakcije genomske DNA iz krvi:
Izračun:
Protokol sekvenciranja zahtijeva točno 500 ng DNA:
Potrebni volumen = 500 ÷ 125 = 4 μL DNA otopine
Evo primjera kako izračunati koncentraciju DNA u raznim programskim jezicima:
1' Excel formula za koncentraciju DNA
2=A260*50*FaktorRazrjeđenja
3
4' Excel formula za ukupnu količinu DNA u μg
5=(A260*50*FaktorRazrjeđenja*Volumen)/1000
6
7' Primjer u ćeliji s A260=0.5, FaktorRazrjeđenja=2, Volumen=100
8=0.5*50*2*100/1000
9' Rezultat: 5 μg
101def calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor=1):
2 """
3 Izračunajte koncentraciju DNA u ng/μL
4
5 Parametri:
6 absorbance (float): Očitavanje apsorpcije na 260nm
7
8 Vraća:
9 float: Koncentracija DNA u ng/μL
10 """
11 return absorbance * 50 * dilution_factor
12
13def calculate_total_dna(concentration, volume_ul):
14 """
15 Izračunajte ukupnu količinu DNA u μg
16
17 Parametri:
18 concentration (float): Koncentracija DNA u ng/μL
19 volume_ul (float): Volumen DNA otopine u μL
20
21 Vraća:
22 float: Ukupna količina DNA u μg
23 """
24 return (concentration * volume_ul) / 1000
25
26# Primjer korištenja
27absorbance = 0.8
28dilution_factor = 5
29volume = 75
30
31concentration = calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor)
32total_dna = calculate_total_dna(concentration, volume)
33
34print(f"Koncentracija DNA: {concentration:.2f} ng/μL")
35print(f"Ukupna DNA: {total_dna:.2f} μg")
36function calculateDNAConcentration(absorbance, dilutionFactor = 1) { // Vraća koncentraciju DNA u ng/μL return absorbance * 50 * dilutionFactor; } function calculateTotalDNA(concentration, volumeUL) { // Vraća ukupnu količinu DNA u μg return (concentration * volumeUL) / 1000; } // Primjer korištenja const absorbance = 0.65; const dilutionFactor = 2; const volume = 100; const concentration =
Otkrijte više alata koji bi mogli biti korisni za vaš radni proces