Kalkulator koncentracije DNA | Pretvarač A260 u ng/μL

Kalkulator koncentracije DNA

Kalkulator koncentracije DNA pretvara očitanje UV apsorbancije pri 260 nanometara, nazvano A260, u koncentraciju DNA u nanogramima po mikrolitru (ng/µL). Također prikazuje ukupnu količinu DNA u uzorku, u mikrogramima (µg).

Što je apsorbancija A260?

A260 je količina ultraljubičastog svjetla koju otopina apsorbira pri valnoj duljini od 260 nanometara. DNA najjače apsorbira UV svjetlo u blizini te valne duljine zbog svojih nukleotidnih baza. Nakon što se mjerenjem slijepe probe, uz isti pufer kao za uzorak, ukloni pozadinska apsorbancija, spektrofotometar mjeri A260. Što je više DNA u otopini, to je očitanje A260 veće.

Formula za koncentraciju DNA

Dvolančana DNA apsorbira UV svjetlo proporcionalno svojoj koncentraciji, što je odnos poznat kao Beer-Lambertov zakon. U standardnom optičkom putu duljine 1 centimetra, otopina s očitanjem A260 od 1,0 sadržava približno 50 ng/µL dvolančane DNA. Taj broj, faktor pretvorbe, pretvara svako očitanje A260 u koncentraciju:

Koncentracija DNA (ng/µL) = A260 × 50 × faktor razrjeđenja

Faktor razrjeđenja uzima u obzir svako razrjeđenje provedeno prije mjerenja uzorka. Uzorak izmjeren bez razrjeđenja ima faktor razrjeđenja 1.

Kako izračunati ukupni prinos DNA

Nakon što je koncentracija poznata, ukupna masa DNA u uzorku može se izračunati iz njegova volumena:

Ukupna DNA (µg) = koncentracija (ng/µL) × volumen (µL) ÷ 1000

Kako izračunati koncentraciju DNA: korak po korak

1. Temeljito promiješajte uzorak prije mjerenja. DNA se može zalijepiti za stijenke epruvete ili se neravnomjerno istaložiti.
2. Razrijedite uzorak ako je jako koncentriran, tako da ciljate na očitanje A260 između 0,1 i 1,0. Očitanja spektrofotometra najmanje su pouzdana izvan tog raspona.
3. Nulirajte spektrofotometar istim puferom koji je upotrijebljen za razrjeđivanje, a zatim izmjerite uzorak pri 260 nm.
4. Unesite očitanje A260, volumen uzorka i faktor razrjeđenja u kalkulator kako biste dobili koncentraciju i ukupni prinos. Sva tri polja moraju biti ispunjena, a volumen mora biti veći od nule da bi se prikazao rezultat.

Primjer izračuna

Primjer 1: nerazrijeđeni uzorak

Očitanje A260 iznosi 0,5, nema razrjeđenja (faktor razrjeđenja 1), a volumen uzorka iznosi 100 µL.

• Koncentracija = 0,5 × 50 × 1 = 25 ng/µL
• Ukupna DNA = 25 × 100 ÷ 1000 = 2,5 µg

Primjer 2: razrijeđeni uzorak

Epruveta sadržava 50 µL pročišćene DNA. Mali dio razrijeđen je 10 puta, a razrijeđeni dio dao je očitanje A260 od 0,75. Faktor razrjeđenja pretvara to očitanje natrag u koncentraciju u izvornoj epruveti, a 50 µL je volumen unesen za izračun ukupnog prinosa.

• Koncentracija = 0,75 × 50 × 10 = 375 ng/µL
• Ukupna DNA = 375 × 50 ÷ 1000 = 18,75 µg

Izračun faktora razrjeđenja

Faktor razrjeđenja = ukupni volumen nakon razrjeđenja ÷ volumen izvornog uzorka.

Dodavanjem 5 µL otopine DNA u 45 µL pufera dobiva se ukupni volumen od 50 µL, pa je faktor razrjeđenja 50 ÷ 5 = 10. Uzorak koji nije razrijeđen ima faktor razrjeđenja 1.

Uobičajeni rasponi koncentracije DNA

Koncentracija ovisi o vrsti uzorka i metodi ekstrakcije. Ekstrakti genomske DNA obično se kreću između približno 10 i 100 ng/µL. Pripravci plazmidne DNA često daju veće koncentracije, ponekad od nekoliko stotina ng/µL. Rezultat koji je znatno izvan očekivanog raspona za određenu metodu može upućivati na problem s ekstrakcijom ili samim mjerenjem.

Ograničenja mjerenja UV apsorbancije

Mjerenje A260 brzo je, ali nije najosjetljivija ni najspecifičnija metoda za DNA. Proteini, RNA i neke komponente pufera također apsorbiraju svjetlo u blizini 260 nm i mogu povećati očitanje. Znanstvenici često provjeravaju omjer A260/A280 uz koncentraciju kako bi utvrdili postoji li kontaminacija proteinima; omjer blizu 1,8 obično upućuje na čist uzorak DNA. Metode s fluorescentnim bojilima, kao što su Qubitovi testovi, vežu se samo za dvolančanu DNA i daju točnije očitanje za razrijeđene ili nečiste uzorke, iako zahtijevaju dodatne reagense i fluorometar.

Često postavljana pitanja

Kako izračunati koncentraciju DNA iz A260?

Pomnožite očitanje A260 s 50, standardnim faktorom pretvorbe za dvolančanu DNA, a zatim s faktorom razrjeđenja. Ako uzorak nije razrijeđen, upotrijebite faktor razrjeđenja 1.

Koji je dobar omjer A260/A280?

Omjer blizu 1,8 obično upućuje na čist uzorak DNA. Niži omjer upućuje na kontaminaciju proteinima. Omjer veći od 2,0 može upućivati na kontaminaciju RNA-om.

Može li se ovaj kalkulator upotrebljavati za RNA?

Ne izravno, jer se za RNA upotrebljava faktor pretvorbe od 40 ng/µL umjesto 50. Za procjenu koncentracije RNA pomnožite rezultat kalkulatora s 0,8 (40 ÷ 50) ili izravno upotrijebite A260 × 40 × faktor razrjeđenja.

Zašto bi očitanje A260 trebalo biti između 0,1 i 1,0?

Apsorbancija ostaje približno proporcionalna koncentraciji, kako opisuje Beer-Lambertov zakon, uglavnom unutar tog raspona. Izvan njega očitanja postaju manje pouzdana, pa uzorak koji je previše koncentriran ili previše razrijeđen treba razrijediti ili koncentrirati prije ponovnog mjerenja.

Koja je razlika između koncentracije i čistoće?

Koncentracija mjeri količinu prisutne DNA, u ng/µL. Čistoća mjeri koliko je uzorak čist, što se uglavnom procjenjuje iz omjera apsorbancija kao što je A260/A280. Uzorak može imati visoku koncentraciju i istodobno biti nečist ili imati nisku koncentraciju i biti vrlo čist.

Kako pretvoriti ng/µL u µg/mL?

Te su dvije jedinice brojčano jednake. 1 ng/µL jednako je 1 µg/mL jer se jedinica mase i jedinica volumena svaka mijenja za faktor 1000.

Reference

1. Sambrook, J., i Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3. izd.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
2. Gallagher, S. R., i Desjardins, P. R. (2006). Quantitation of DNA and RNA with absorption and fluorescence spectroscopy. Current Protocols in Molecular Biology, 76(1), A-3D.
3. Manchester, K. L. (1995). Value of A260/A280 ratios for measurement of purity of nucleic acids. BioTechniques, 19(2), 208–210.