Kalkulator DNA ligacije - Izračunajte omjere insert:vektor za molekularno kloniranje

Ligacija DNA korak je u molekularnom kloniranju tijekom kojeg se fragment inserta spaja s plazmidnim vektorom enzimom T4 DNA-ligazom. Kalkulator ligacije DNA izračunava koliko mikrolitara DNA inserta i DNA vektora treba pomiješati kako bi reakcija postigla odabrani molarni omjer inserta i vektora.

Što kalkulator radi

Kalkulator prihvaća šest ulaznih podataka: koncentraciju vektora, duljinu vektora, koncentraciju inserta, duljinu inserta, ciljani molarni omjer inserta i vektora te ukupni volumen reakcije. Omogućuje i postavljanje količine DNA vektora koja će se upotrijebiti; zadana je vrijednost 50 nanograma (ng). Na temelju tih vrijednosti izračunava volumen vektora za pipetiranje, volumen inserta za pipetiranje te količinu pufera ili vode koju treba dodati da bi se dosegnuo ukupni volumen reakcije.

Koncentracija se mjeri u nanogramima po mikrolitru (ng/μL), obično očitanima na instrumentu Nanodrop ili Qubit. Duljina se mjeri u baznim parovima (bp). Jedan kilobaz (kb) jednak je 1000 baznih parova. Molarni omjer opisuje koliko molekula inserta treba biti prisutno na svaku molekulu vektora. To nije omjer masa.

Zašto se upotrebljava molarni omjer, a ne masa

Jednake mase DNA ne sadržavaju jednak broj molekula. Kratki insert ima manju masu od dugog vektora s jednakim brojem molekula. Miješanjem jednakih količina kratkog inserta i dugog vektora izraženih u nanogramima dobilo bi se premalo molekula inserta u odnosu na molekule vektora. Kalkulator prilagođava masu inserta omjeru duljina fragmenata, tako da konačna smjesa sadržava predviđeni broj molekula inserta po molekuli vektora.

Formula za ligaciju DNA

Potrebna količina DNA inserta, izražena u nanogramima, iznosi:

$m_i = m_v \times \frac{k_i}{k_v} \times R$

pri čemu je $m_i$ količina inserta u nanogramima, $m_v$ količina vektora u nanogramima, $k_i$ duljina inserta u kilobaznim parovima, $k_v$ duljina vektora u kilobaznim parovima, a R ciljani molarni omjer inserta i vektora.

Nakon što je ta količina poznata, kalkulator svaku količinu pretvara u volumen prikladan za pipetiranje:

$V_v = \frac{m_v}{c_v}$

$V_i = \frac{m_i}{c_i}$

$V_b = V_t - V_v - V_i$

pri čemu su $V_v$ i $V_i$ volumeni vektora i inserta u mikrolitrima, $c_v$ i $c_i$ koncentracije vektora i inserta u nanogramima po mikrolitru, $V_b$ volumen pufera, a $V_t$ ukupni volumen reakcije.

Ako su volumen vektora i volumen inserta zajedno veći od ukupnog volumena reakcije, ne preostaje prostora za pufer, ligazu ili vodu. U tom slučaju kalkulator prijavljuje da je ukupni volumen premalen, umjesto da prikaže negativnu količinu pufera.

Primjer izračuna

Istraživač klonira genski fragment od 1 kb u plazmidni vektor od 3 kb. Planira upotrijebiti 50 ng DNA vektora pri molarnom omjeru inserta i vektora 3:1, u reakciji volumena 20 μL.

Ulazni podaci:

• Koncentracija vektora: 50 ng/μL
• Duljina vektora: 3000 bp (3 kb)
• Koncentracija inserta: 25 ng/μL
• Duljina inserta: 1000 bp (1 kb)
• Molarni omjer: 3
• Ukupni volumen: 20 μL
• Količina vektora: 50 ng

Korak 1: količina inserta

ng inserta = 50 × (1 ÷ 3) × 3 = 50 ng

Korak 2: volumeni

Volumen vektora = 50 ng ÷ 50 ng/μL = 1 μL

Volumen inserta = 50 ng ÷ 25 ng/μL = 2 μL

Volumen pufera = 20 − 1 − 2 = 17 μL

Reakcija se sastoji od 1 μL vektora, 2 μL inserta i 17 μL pufera ili vode, u što se također dodaju ligaza i njezin reakcijski pufer. Ova smjesa daje tri molekule inserta na svaku molekulu vektora.

Uobičajeni molarni omjeri za ligaciju

U većini standardnih kloniranja s ljepljivim, izbočenim krajevima upotrebljava se omjer inserta i vektora 3:1. Ligacije kojima se spajaju tupi krajevi manje su učinkovite, pa je uobičajen veći omjer, primjerice 5:1. Vrlo veliki inserti ponekad bolje funkcioniraju s manjim omjerom, bližim 1:1, jer veliki fragmenti već daju mnogo baznih parova po molekuli.

Često postavljana pitanja

Što je ligacija DNA?

Ligacija DNA jest spajanje dvaju fragmenata DNA, obično plazmidnog vektora i inserta, u jednu neprekinutu molekulu. Enzim T4 DNA-ligaza zatvara spoj između krajeva fragmenata.

Što znači molarni omjer inserta i vektora?

To je broj molekula DNA inserta prisutnih na svaku molekulu vektora u reakciji. Omjer 3:1 znači tri molekule inserta na svaku molekulu vektora, neovisno o usporedbi njihovih masa.

Zašto se ne upotrebljavaju jednake količine vektora i inserta izražene u nanogramima?

Fragmenti DNA različitih duljina imaju različite mase po molekuli. Insert od 1 kb ima približno trećinu mase vektora od 3 kb, molekulu po molekulu. Jednake količine svakog fragmenta izražene u nanogramima ne bi dale jednak broj molekula, pa kalkulator prilagođava masu inserta kako bi se postigao ciljani molarni omjer.

Što znači ako je ukupni volumen premalen?

To znači da volumeni vektora i inserta sami već ispunjavaju cijeli volumen reakcije, pa nema prostora za pufer ili ligazu. Rješenje je povećati ukupni volumen reakcije ili upotrijebiti koncentriranije zalihe DNA.

Može li se ovaj kalkulator upotrebljavati za kloniranje metodama Gibson Assembly ili Golden Gate?

Ne. Te metode upotrebljavaju različitu kemiju reakcije i obično ciljaju na ekvimolarne količine svih fragmenata, a ne na fiksni omjer inserta i vektora. Njihovi izračuni volumena razlikuju se od standardnog kloniranja s T4-ligazom.

Koliko se DNA vektora obično upotrebljava?

50 ng uobičajena je početna količina za standardnu ligacijsku reakciju. U laboratorijima se upotrebljavaju i količine od 25 do 100 ng, prilagođene koncentraciji DNA i opsegu reakcije.