DNA Ligation Calculator

Uvod

DNA ligacija je ključna tehnika molekularne biologije koja se koristi za spajanje DNA fragmenata zajedno sa kovalentnim vezama. DNA Ligation Calculator je neophodan alat za istraživače, pomažući u određivanju optimalnih količina vektora i umetnute DNA potrebnih za uspešne ligacione reakcije. Izračunavanjem ispravnih molarnih odnosa između vektora (plazmida) i umetnutih DNA fragmenata, ovaj kalkulator osigurava efikasne eksperimente molekularnog kloniranja uz minimalno rasipanje reagenasa i neuspešnih reakcija.

Ligacione reakcije su temelj genetskog inženjeringa, sintetičke biologije i procedura molekularnog kloniranja. Omogućavaju naučnicima da kreiraju rekombinantne DNA molekule umetajući gene od interesa u plazmid vektore za naknadnu transformaciju u domaćinske organizme. Uspeh ovih reakcija u velikoj meri zavisi od korišćenja odgovarajućih količina DNA komponenti, što je upravo ono što ovaj kalkulator pomaže da se odredi.

Bez obzira da li konstruirate izražajne vektore, kreirate biblioteke gena ili obavljate rutinsko subkloniranje, ovaj DNA ligation calculator će vam pomoći da optimizujete svoje eksperimentalne uslove i povećate stopu uspeha. Unoseći nekoliko ključnih parametara o vašim DNA uzorcima, možete brzo dobiti tačne zapremine potrebne za vašu specifičnu ligacionu reakciju.

Formula/Izračunavanje

DNA ligation calculator koristi osnovnu formulu molekularne biologije koja uzima u obzir različite veličine i koncentracije DNA fragmenata koji se spajaju. Primarno izračunavanje određuje koliko umetnute DNA je potrebno u odnosu na vektorsku DNA na osnovu njihovih dužina i željenog molarnog odnosa.

Izračunavanje količine umetnute DNA

Količina potrebne umetnute DNA (u nanogramima) izračunava se pomoću sledeće formule:

$\text{ng umetnute} = \text{ng vektora} \times \frac{\text{kb veličina umetnute}}{\text{kb veličina vektora}} \times \text{molarni odnos}$

Gde:

• ng vektora = količina vektorske DNA korišćena u reakciji (obično 50-100 ng)
• kb veličina umetnute = dužina umetnutog DNA fragmenta u kilobazama (kb)
• kb veličina vektora = dužina vektorske DNA u kilobazama (kb)
• molarni odnos = željeni odnos umetnutih molekula u odnosu na vektorske molekule (obično 3:1 do 5:1)

Izračunavanje zapremina

Kada se odredi potrebna količina umetnute DNA, izračunavaju se potrebne zapremine za reakciju:

$\text{Zapremina vektora (μL)} = \frac{\text{ng vektora}}{\text{koncentracija vektora (ng/μL)}}$

$\text{Zapremina umetnute (μL)} = \frac{\text{ng umetnute}}{\text{koncentracija umetnute (ng/μL)}}$

$\text{Zapremina pufera/vode (μL)} = \text{Ukupna zapremina reakcije (μL)} - \text{Zapremina vektora (μL)} - \text{Zapremina umetnute (μL)}$

Primer izračunavanja

Hajde da prođemo kroz praktičan primer:

• Koncentracija vektora: 50 ng/μL
• Dužina vektora: 3000 bp (3 kb)
• Koncentracija umetnute: 25 ng/μL
• Dužina umetnute: 1000 bp (1 kb)
• Željeni molarni odnos (umetnuta:vektor): 3:1
• Ukupna zapremina reakcije: 20 μL
• Količina vektora koja se koristi: 50 ng

Korak 1: Izračunajte potrebnu količinu umetnute $\text{ng umetnute} = 50 \text{ ng} \times \frac{1 \text{ kb}}{3 \text{ kb}} \times 3 = 50 \times 0.33 \times 3 = 50 \text{ ng}$

Korak 2: Izračunajte zapremine $\text{Zapremina vektora} = \frac{50 \text{ ng}}{50 \text{ ng/μL}} = 1 \text{ μL}$

$\text{Zapremina umetnute} = \frac{50 \text{ ng}}{25 \text{ ng/μL}} = 2 \text{ μL}$

$\text{Zapremina pufera/vode} = 20 \text{ μL} - 1 \text{ μL} - 2 \text{ μL} = 17 \text{ μL}$

Ovo izračunavanje osigurava da postoji tri umetnute molekula za svaki vektorski molekul u reakciji, optimizujući šanse za uspešnu ligaciju.

Vodič korak-po-korak za korišćenje kalkulatora

Naš DNA Ligation Calculator je dizajniran da bude intuitivan i jednostavan. Pratite ove korake da izračunate optimalne zapremine za vašu ligacionu reakciju:

1. Unesite informacije o vektoru:

   • Unesite koncentraciju vašeg vektora u ng/μL
   • Unesite dužinu vektora u baznim parovima (bp)
   • Navedite količinu vektorske DNA koju želite koristiti u reakciji (ng)

2. Unesite informacije o umetnutoj:

   • Unesite koncentraciju vaše umetnute DNA u ng/μL
   • Unesite dužinu umetnute DNA u baznim parovima (bp)

3. Postavite parametre reakcije:

   • Navedite željeni molarni odnos (umetnuta:vektor) - obično između 3:1 i 5:1
   • Unesite ukupnu zapreminu reakcije u μL (obično 10-20 μL)

4. Pogledajte rezultate:

   • Kalkulator će automatski prikazati:
     • Potrebna zapremina vektora (μL)
     • Potrebna zapremina umetnute (μL)
     • Zapremina pufera/vode za dodavanje (μL)
     • Ukupna zapremina reakcije (μL)
     • Količina vektora i umetnute DNA u reakciji (ng)

5. Kopirajte rezultate (opciono):

   • Koristite dugme "Kopiraj rezultate" da kopirate sve izračunavanja u vaš međuspremnik za vaš laboratorijski dnevnik ili protokole

Kalkulator vrši provere validacije kako bi osigurao da su svi unosi pozitivni brojevi i da je ukupna zapremina dovoljna za potrebne DNA zapremine. Ako se otkriju bilo kakve greške, korisne poruke o grešci će vas uputiti da ispravite unose.

Upotrebe

DNA Ligation Calculator je dragocen alat u brojnim aplikacijama molekularne biologije:

Molekularno kloniranje

Najčešća upotreba je standardno molekularno kloniranje, gde istraživači umetnu gene ili DNA fragmente u plazmid vektore. Kalkulator osigurava optimalne uslove za:

• Subkloniranje gena između različitih izražajnih vektora
• Kreiranje fuzionih proteina spajanjem više genetskih fragmenata
• Konstrukciju reporter gena
• Izgradnju plazmid biblioteka

Sintetička biologija

U sintetičkoj biologiji, gde se često sastavljaju više DNA fragmenata:

• Gibson Assembly reakcije imaju koristi od preciznih odnosa umetnuta:vektor
• Golden Gate sistemi za sastavljanje zahtevaju specifične koncentracije DNA
• BioBrick sastavljanje standardizovanih genetskih delova
• Konstrukcija sintetičkih genetskih krugova

Razvoj dijagnostičkih setova

Prilikom razvoja molekularnih dijagnostičkih alata:

• Kloniranje genetskih markera specifičnih za bolesti
• Konstrukcija pozitivnih kontrolnih plazmida
• Razvoj kalibracionih standarda za qPCR

Sistemi za izražavanje proteina

Za istraživače koji rade na proizvodnji proteina:

• Optimizacija odnosa umetnuta:vektor za vektore visoke kopije
• Konstrukcija inducibilnih sistema za izražavanje
• Kreiranje sekrecionih vektora za pročišćavanje proteina

CRISPR-Cas9 aplikacije

U aplikacijama genomske editacije:

• Kloniranje vodiča RNA u CRISPR vektore
• Kreiranje donorskih šablona za homolognu usmerenu reparaciju
• Izgradnja biblioteka vodiča RNA za screening

Izazovne ligacije

Kalkulator je posebno dragocen za izazovne scenarije ligacije:

• Kloniranje velikih umetnuta (>5 kb)
• Umetanja vrlo malih fragmenata (<100 bp)
• Blunt-end ligacije koje imaju nižu efikasnost
• Reakcije sastavljanja više fragmenata

Alternativne metode

Dok naš DNA Ligation Calculator pruža precizna izračunavanja za tradicionalne ligacione reakcije, nekoliko alternativnih pristupa postoji za spajanje DNA fragmenata:

1. Gibson Assembly: Koristi egzonukleazu, polimerazu i ligazu u jednoj reakciji u jednoj epruveti za spajanje preklapajućih DNA fragmenata. Nema potrebe za tradicionalnim izračunavanjem ligacije, ali su odnosi koncentracije i dalje važni.

2. Golden Gate Assembly: Koristi tip IIS restrikcione enzime za usmereno, bez ožiljaka sastavljanje više fragmenata. Zahteva ekvivalentne količine svih fragmenata.

3. SLIC (Sequence and Ligation Independent Cloning): Koristi egzonukleazu za stvaranje jednostrukih preklopa koji se međusobno spajaju. Obično koristi ekvivalentne odnose fragmenata.

4. In-Fusion Cloning: Komercijalni sistem koji omogućava spajanje fragmenata sa 15 bp preklopima. Koristi specifičan odnos zasnovan na veličinama fragmenata.

5. Gateway Cloning: Koristi specifičnu recombinaciju umesto ligacije. Zahteva specifične ulazne i odredišne vektore.

6. Empirijsko testiranje: Neki laboratoriji preferiraju da postave više ligacionih reakcija sa različitim odnosima umetnuta:vektor (1:1, 3:1, 5:1, 10:1) i utvrde koji najbolje funkcioniše za njihove specifične konstrukte.

7. Softverski kalkulatori: Komercijalni softverski paketi poput Vector NTI i SnapGene uključuju kalkulatore ligacije sa dodatnim funkcijama kao što su analiza restrikcionih mesta.

Istorija

Razvoj izračunavanja DNA ligacije prati evoluciju tehnika molekularnog kloniranja, koje su revolucionisale molekularnu biologiju i biotehnologiju.

Rani razvoj (1970-ih)

Koncept DNA ligacije za molekularno kloniranje pojavio se početkom 1970-ih sa pionirskim radom Paula Berga, Herberta Boyera i Stanleya Cohena, koji su razvili prve rekombinantne DNA molekule. Tokom ovog perioda, ligacione reakcije su bile uglavnom empirične, a istraživači su koristili pokušaje i greške kako bi odredili optimalne uslove.

Otkrivanje restrikcionih enzima i DNA ligaze obezbedilo je osnovne alate za sečenje i ponovo spajanje DNA molekula. T4 DNA ligaza, izolovana iz T4 bakteriofaga zaraženih E. coli, postala je standardni enzim za spajanje DNA fragmenata zbog svoje sposobnosti da ligira i blunt i kohezivne krajeve.

Period rafinacije (1980-1990)

Kako je molekularno kloniranje postalo rutinsko, istraživači su počeli da razvijaju sistematičnije pristupe ligacionim reakcijama. Važnost molarnih odnosa između vektorske i umetnute DNA postala je očigledna, što je dovelo do razvoja osnovne formule koja se i danas koristi.

Tokom ovog perioda, istraživači su utvrdili da viška umetnute DNA (obično 3:1 do 5:1 molarni odnos umetnuta:vektor) obično poboljšava efikasnost ligacije za standardne aplikacije kloniranja. Ova saznanja su prvobitno deljena kroz laboratorijske protokole i postepeno su se našla u priručnicima i udžbenicima molekularne biologije.

Moderna era (2000-danas)

Pojava računarskih alata i online kalkulatora u 2000-im učinila je precizna izračunavanja ligacije dostupnijim istraživačima. Kako su tehnike molekularne biologije postajale sofisticiranije, potreba za tačnim izračunavanjima postala je kritična, posebno za izazovne projekte kloniranja koji uključuju više fragmenata ili velike umetnute.

Danas su izračunavanja DNA ligacije integralni deo radnih tokova molekularnog kloniranja, a posvećeni kalkulatori poput ovog pomažu istraživačima da optimizuju svoje eksperimente. Osnovna formula je ostala uglavnom nepromenjena, iako se naše razumevanje faktora koji utiču na efikasnost ligacije poboljšalo.

Pojava alternativnih metoda kloniranja poput Gibson Assembly i Golden Gate kloniranja uvela je nove potrebe za izračunavanjem, ali osnovni koncept molarnih odnosa između DNA fragmenata ostaje važan u svim ovim tehnikama.

Primeri koda

Evo implementacija DNA ligation kalkulatora u raznim programskim jezicima:

1' Excel VBA funkcija za DNA Ligation Calculator
2Function CalculateInsertAmount(vectorAmount As Double, vectorLength As Double, insertLength As Double, molarRatio As Double) As Double
3    ' Izračunajte potrebnu količinu umetnute u ng
4    CalculateInsertAmount = vectorAmount * (insertLength / vectorLength) * molarRatio
5End Function
6
7Function CalculateVectorVolume(vectorAmount As Double, vectorConcentration As Double) As Double
8    ' Izračunajte zapreminu vektora u μL
9    CalculateVectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration
10End Function
11
12Function CalculateInsertVolume(insertAmount As Double, insertConcentration As Double) As Double
13    ' Izračunajte zapreminu umetnute u μL
14    CalculateInsertVolume = insertAmount / insertConcentration
15End Function
16
17Function CalculateBufferVolume(totalVolume As Double, vectorVolume As Double, insertVolume As Double) As Double
18    ' Izračunajte zapreminu pufera/vode u μL
19    CalculateBufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume
20End Function
21
22' Primer korišćenja u ćeliji:
23' =CalculateInsertAmount(50, 3000, 1000, 3)
24

1def calculate_ligation_volumes(vector_concentration, vector_length, insert_concentration, 
2                              insert_length, molar_ratio, total_volume, vector_amount=50):
3    """
4    Izračunajte zapremine za ligacionu reakciju DNA.
5    
6    Parametri:
7    vector_concentration (float): Koncentracija vektorske DNA u ng/μL
8    vector_length (float): Dužina vektorske DNA u baznim parovima
9    insert_concentration (float): Koncentracija umetnute DNA u ng/μL
10    insert_length (float): Dužina umetnute DNA u baznim parovima
11    molar_ratio (float): Željeni molarni odnos umetnuta:vektor
12    total_volume (float): Ukupna zapremina reakcije u μL
13    vector_amount (float): Količina vektorske DNA koju treba koristiti u ng (podrazumevano: 50)
14    
15    Vraća:
16    dict: Rečnik koji sadrži izračunate zapremine i količine
17    """
18    # Izračunajte zapreminu vektora
19    vector_volume = vector_amount / vector_concentration
20    
21    # Izračunajte potrebnu količinu umetnute
22    vector_length_kb = vector_length / 1000
23    insert_length_kb = insert_length / 1000
24    insert_amount = (vector_amount * insert_length_kb / vector_length_kb) * molar_ratio
25    
26    # Izračunajte zapreminu umetnute
27    insert_volume = insert_amount / insert_concentration
28    
29    # Izračunajte zapreminu pufera/vode
30    buffer_volume = total_volume - vector_volume - insert_volume
31    
32    return {
33        "vector_volume": round(vector_volume, 2),
34        "insert_volume": round(insert_volume, 2),
35        "buffer_volume": round(buffer_volume, 2),
36        "insert_amount": round(insert_amount, 2),
37        "vector_amount": vector_amount
38    }
39
40# Primer korišćenja
41result = calculate_ligation_volumes(
42    vector_concentration=50,
43    vector_length=3000,
44    insert_concentration=25,
45    insert_length=1000,
46    molar_ratio=3,
47    total_volume=20
48)
49
50print(f"Vektor: {result['vector_volume']} μL ({result['vector_amount']} ng)")
51print(f"Umetnuta: {result['insert_volume']} μL ({result['insert_amount']} ng)")
52print(f"Pufer: {result['buffer_volume']} μL")
53print(f"Ukupno: 20 μL")
54

1function calculateLigationVolumes(vectorConcentration, vectorLength, insertConcentration, 
2                                insertLength, molarRatio, totalVolume, vectorAmount = 50) {
3  // Konvertujte dužine u kb za izračunavanje
4  const vectorLengthKb = vectorLength / 1000;
5  const insertLengthKb = insertLength / 1000;
6  
7  // Izračunajte potrebnu količinu umetnute
8  const insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
9  
10  // Izračunajte zapremine
11  const vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
12  const insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
13  const bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
14  
15  return {
16    vectorVolume: parseFloat(vectorVolume.toFixed(2)),
17    insertVolume: parseFloat(insertVolume.toFixed(2)),
18    bufferVolume: parseFloat(bufferVolume.toFixed(2)),
19    insertAmount: parseFloat(insertAmount.toFixed(2)),
20    vectorAmount: vectorAmount
21  };
22}
23
24// Primer korišćenja
25const result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
26console.log(`Vektor: ${result.vectorVolume} μL (${result.vectorAmount} ng)`);
27console.log(`Umetnuta: ${result.insertVolume} μL (${result.insertAmount} ng)`);
28console.log(`Pufer: ${result.bufferVolume} μL`);
29console.log(`Ukupno: 20 μL`);
30

1public class DNALigationCalculator {
2    public static class LigationResult {
3        public final double vectorVolume;
4        public final double insertVolume;
5        public final double bufferVolume;
6        public final double insertAmount;
7        public final double vectorAmount;
8        
9        public LigationResult(double vectorVolume, double insertVolume, double bufferVolume, 
10                             double insertAmount, double vectorAmount) {
11            this.vectorVolume = vectorVolume;
12            this.insertVolume = insertVolume;
13            this.bufferVolume = bufferVolume;
14            this.insertAmount = insertAmount;
15            this.vectorAmount = vectorAmount;
16        }
17    }
18    
19    public static LigationResult calculateLigationVolumes(
20            double vectorConcentration, double vectorLength, 
21            double insertConcentration, double insertLength,
22            double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount) {
23        
24        // Konvertujte dužine u kb
25        double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
26        double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
27        
28        // Izračunajte potrebnu količinu umetnute
29        double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
30        
31        // Izračunajte zapremine
32        double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
33        double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
34        double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
35        
36        // Zaokružite na 2 decimalna mesta
37        vectorVolume = Math.round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
38        insertVolume = Math.round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
39        bufferVolume = Math.round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
40        insertAmount = Math.round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
41        
42        return new LigationResult(vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount);
43    }
44    
45    public static void main(String[] args) {
46        LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20, 50);
47        
48        System.out.printf("Vektor: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.vectorVolume, result.vectorAmount);
49        System.out.printf("Umetnuta: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.insertVolume, result.insertAmount);
50        System.out.printf("Pufer: %.2f μL%n", result.bufferVolume);
51        System.out.printf("Ukupno: 20 μL%n");
52    }
53}
54

1#include <iostream>
2#include <cmath>
3#include <iomanip>
4
5struct LigationResult {
6    double vectorVolume;
7    double insertVolume;
8    double bufferVolume;
9    double insertAmount;
10    double vectorAmount;
11};
12
13LigationResult calculateLigationVolumes(
14    double vectorConcentration, double vectorLength,
15    double insertConcentration, double insertLength,
16    double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount = 50.0) {
17    
18    // Konvertujte dužine u kb
19    double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
20    double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
21    
22    // Izračunajte potrebnu količinu umetnute
23    double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
24    
25    // Izračunajte zapremine
26    double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
27    double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
28    double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
29    
30    // Zaokružite na 2 decimalna mesta
31    vectorVolume = std::round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
32    insertVolume = std::round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
33    bufferVolume = std::round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
34    insertAmount = std::round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
35    
36    return {vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount};
37}
38
39int main() {
40    LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
41    
42    std::cout << std::fixed << std::setprecision(2);
43    std::cout << "Vektor: " << result.vectorVolume << " μL (" << result.vectorAmount << " ng)" << std::endl;
44    std::cout << "Umetnuta: " << result.insertVolume << " μL (" << result.insertAmount << " ng)" << std::endl;
45    std::cout << "Pufer: " << result.bufferVolume << " μL" << std::endl;
46    std::cout << "Ukupno: 20 μL" << std::endl;
47    
48    return 0;
49}
50

Često postavljana pitanja (FAQ)

Koji je optimalni molarni odnos za DNA ligaciju?

Optimalni molarni odnos umetnuta prema vektoru obično se kreće od 3:1 do 5:1 za standardne ligacione aplikacije. Međutim, ovo može varirati u zavisnosti od specifičnog scenarija ligacije:

• Za blunt-end ligacije: 3:1 do 5:1
• Za sticky-end ligacije: 1:1 do 3:1
• Za velike umetnute (>10 kb): 1:1 do 2:1
• Za male umetnute (<500 bp): 5:1 do 10:1
• Za sastavljanje više fragmenata: 3:1 za svaki umetnuti u odnosu na vektor

Zašto moja ligaciona reakcija ne uspeva uprkos korišćenju izračunatih zapremina?

Nekoliko faktora može uticati na efikasnost ligacije pored molarnog odnosa:

1. Kvalitet DNA: Osigurajte da su i vektor i umetnuta čisti krajevi bez oštećenja
2. Defofosforilacija: Proverite da li je vaš vektor defosforilovan, što sprečava samoligaciju
3. Aktivnost enzima: Proverite da li je vaša ligaza aktivna i korišćena na pravoj temperaturi
4. Vreme inkubacije: Neke ligacije imaju koristi od dužih inkubacija (preko noći na 16°C)
5. Uslovi pufera: Osigurajte da se koristi pravilan pufer sa ATP-om
6. Kontaminanti: Pročišćavajte DNA kako biste uklonili inhibitore poput EDTA ili visokog natrijuma

Koliko vektorske DNA treba da koristim u ligacionoj reakciji?

Obično se preporučuje korišćenje 50-100 ng vektorske DNA za standardne ligacione reakcije. Korišćenje previše vektora može dovesti do većeg pozadinskog signala nekontrolisanog ili samoligiranog vektora, dok premalo može smanjiti efikasnost transformacije. Za izazovne ligacije, možda ćete morati da optimizujete ovu količinu.

Trebam li prilagoditi izračunavanja za blunt-end u odnosu na sticky-end ligacije?

Da. Blunt-end ligacije su obično manje efikasne od sticky-end (kohezivnih) ligacija. Za blunt-end ligacije, koristite:

• Više molarne odnose (3:1 do 5:1 ili čak više)
• Više T4 DNA ligaze (obično 2-3 puta više)
• Duža vremena inkubacije
• Razmotrite dodavanje PEG-a za poboljšanje efikasnosti ligacije

Kako da izračunam ligaciju za više umetnutih?

Za sastavljanje više fragmenata:

1. Izračunajte svaku umetnutu količinu pojedinačno koristeći istu formulu
2. Održavajte isti ukupni molarni odnos (npr. za dva umetnuta, koristite 1.5:1.5:1 umetnuta1:umetnuta2:vektor)
3. Prilagodite ukupnu zapreminu reakcije kako biste obuhvatili sve DNA fragmente
4. Razmotrite sekvencijalnu ligaciju ili korišćenje metoda sastavljanja poput Gibson Assembly za više fragmenata

Mogu li koristiti ovaj kalkulator za Gibson Assembly ili Golden Gate Assembly?

Ovaj kalkulator je posebno dizajniran za tradicionalno kloniranje zasnovano na restrikciji i ligaciji. Za Gibson Assembly, obično se preporučuju ekvivalentne količine svih fragmenata (1:1 odnos), iako je osnovno izračunavanje količine DNA na osnovu dužine slično. Za Golden Gate Assembly, takođe se obično koriste ekvivalentni odnosi svih komponenti.

Kako da uzmem u obzir defosforilaciju vektora u svojim izračunavanjima?

Defosforilacija vektora (uklanjanje 5' fosfatnih grupa) sprečava samoligaciju, ali ne menja izračunavanja količina. Međutim, za defosforilisane vektore:

1. Koristite svežu umetnutu DNA sa netaknutim 5' fosfatima
2. Razmotrite korišćenje nešto viših odnosa umetnuta:vektor (4:1 do 6:1)
3. Osigurajte duža vremena ligacije (najmanje 1 sat na sobnoj temperaturi ili preko noći na 16°C)

Koja je minimalna ukupna zapremina reakcije koju treba koristiti?

Minimalna praktična zapremina reakcije obično je 10 μL, što omogućava adekvatno mešanje i sprečava probleme sa isparavanjem. Ako vaše izračunate zapremine DNA premašuju željenu zapreminu reakcije, imate nekoliko opcija:

1. Koristite koncentrisanije uzorke DNA
2. Smanjite količinu vektora koja se koristi (npr. 25 ng umesto 50 ng)
3. Povećajte ukupnu zapreminu reakcije
4. Razmotrite koncentrisanje vaših DNA uzoraka

Koliko dugo treba da inkubiram svoju ligacionu reakciju?

Optimalna vremena inkubacije variraju u zavisnosti od tipa ligacije:

• Sticky-end ligacije: 1 sat na sobnoj temperaturi (22-25°C) ili 4-16 sati na 16°C
• Blunt-end ligacije: 2-4 sata na sobnoj temperaturi ili preko noći (12-16 sati) na 16°C
• Brze ligacije (koristeći ligazu visoke koncentracije): 5-15 minuta na sobnoj temperaturi

Mogu li ponovo koristiti preostalu ligacionu reakciju za transformaciju?

Da, ligacione mešavine se obično mogu čuvati na -20°C i ponovo koristiti za transformaciju. Međutim, svaka ciklus zamrzavanja-odmrzavanja može smanjiti efikasnost. Za najbolje rezultate:

1. Alikvotirajte ligacionu mešavinu pre zamrzavanja
2. Toplotno inaktivirajte ligazu (65°C tokom 10 minuta) pre skladištenja
3. Koristite unutar 1-2 meseca za optimalne rezultate

Reference

1. Sambrook J, Russell DW. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3. izd.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

2. Green MR, Sambrook J. (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4. izd.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

3. Engler C, Kandzia R, Marillonnet S. (2008). A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS ONE, 3(11), e3647. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003647

4. Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. (2009). Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods, 6(5), 343-345. https://doi.org/10.1038/nmeth.1318

5. Aslanidis C, de Jong PJ. (1990). Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research, 18(20), 6069-6074. https://doi.org/10.1093/nar/18.20.6069

6. Zimmerman SB, Pheiffer BH. (1983). Macromolecular crowding allows blunt-end ligation by DNA ligases from rat liver or Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences, 80(19), 5852-5856. https://doi.org/10.1073/pnas.80.19.5852

7. Addgene - Molecular Biology Reference. https://www.addgene.org/mol-bio-reference/

8. New England Biolabs (NEB) - DNA Ligation Protocol. https://www.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202

9. Thermo Fisher Scientific - Molecular Cloning Technical Reference. https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center.html

10. Promega - Cloning Technical Manual. https://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/cloning/