DNS Kópiaszám Kalkulátor | Genomikai Elemző Eszköz

DNS-kópiaszám-kalkulátor

A DNS-kópiaszám-kalkulátor megbecsüli, hogy egy célzott szekvencia hány példányban található meg egy DNS-mintában. A számítást a minta koncentrációja, térfogata és az alapján végzi, hogy a célzott szekvencia milyen gyakran fordul elő a hosszabb DNS-szekvencián belül. A molekuláris biológiai laboratóriumok ilyen becslést használnak többek között olyan kísérletek megtervezéséhez, mint a qPCR (kvantitatív polimeráz-láncreakció), még egy költségesebb és pontosabb vizsgálat elvégzése előtt.

Mit jelent a DNS-kópiaszám?

A DNS kópiaszáma azt jelzi, hogy egy adott szekvencia hányszor fordul elő egy genomban vagy mintában. Egy tipikus emberi gén két példányban található meg, egy-egy példányt örökölve mindkét szülőtől. Ezt a számot több tényező is megváltoztathatja.

• Génamplifikáció: kettőnél több példány. A rákos sejtek gyakran amplifikálják a növekedést elősegítő géneket, például egyes emlődaganatokban a HER2 gént.
• Deléció: kettőnél kevesebb, esetenként nulla példány. A deléciók genetikai rendellenességeket okozhatnak.
• Duplikáció: egy további példány jelenik meg ott, ahol eredetileg csak egy vagy két példánynak kellene lennie.
• Kópiaszám-variáció (CNV): a kópiaszám egyének közötti, normális eltérése, amely az emberi genom jelentős részében megtalálható.

A DNS kópiaszámának képlete

A kalkulátor a szekvencia előfordulásaiból és a minta tömegéből a következő képlettel számítja ki a kópiaszámot:

$\text{Kópiaszám} = \frac{\text{Előfordulások} \times \text{Koncentráció} \times \text{Térfogat} \times N_A}{\text{DNS hossza} \times 660 \times 10^{9}}$

Ahol:

• Előfordulások — annak száma, hogy a célzott szekvencia hányszor fordul elő a teljes DNS-szekvenciában; az egymást átfedő egyezéseket külön kell számolni.
• Koncentráció — a DNS koncentrációja nanogramm/mikroliterben (ng/μL), amelyet rendszerint spektrofotométerrel vagy fluorométerrel mérnek.
• Térfogat — a minta térfogata mikroliterben (μL).
• $N_A$ — Avogadro-szám, 6,022 × 10²³ molekula mólonként. A DNS mólszámát molekulaszámmá alakítja.
• DNS hossza — a teljes DNS-szekvencia hossza bázispárokban.
• 660 — egy DNS-bázispár átlagos molekulatömege gramm/mólban (g/mol). A bázispár két párosodott nukleotidból áll, amelyek közül az egyik a DNS egyik, a másik a másik száláról származik.
• 10⁹ — a nanogrammokat grammá alakítja.

A képlet először a minta tömegét DNS-molekulák mólszámává alakítja, majd az Avogadro-számmal megszorozva meghatározza a mintában található DNS-molekulák teljes számát, végül pedig megszorozza azzal, hogy a célzott szekvencia egy molekulán belül hányszor fordul elő.

Az eszköz csak az A, T, C és G betűket fogadja el. A szóközöket és a sortöréseket figyelmen kívül hagyja, a kisbetűs és a nagybetűs betűket pedig azonosnak tekinti.

A DNS kópiaszámának kiszámítása: kidolgozott példa

Vegyünk egy 12 bázispárból álló DNS-szekvenciát, ATCGATCGATCG, amelyben a célzott szekvencia ATCG, a koncentráció 10 ng/μL, a térfogat pedig 20 μL.

1. lépés: Az előfordulások megszámolása. Az ATCG 3 alkalommal fordul elő az ATCGATCGATCG szekvenciában, a 1., 5. és 9. pozícióban.

2. lépés: A teljes DNS-tömeg meghatározása. Koncentráció × térfogat = 10 × 20 = 200 ng.

3. lépés: Átszámítás mólszámra. 200 ng = 2 × 10⁻⁷ g. Osszuk el (12 bázispár × 660 g/mol) = 7 920 g/mol értékkel. Ebből 2,53 × 10⁻¹¹ mol adódik.

4. lépés: Átszámítás molekulaszámra. Szorozzuk meg az Avogadro-számmal: 2,53 × 10⁻¹¹ mol × 6,022 × 10²³ molekula/mol ≈ 1,52 × 10¹³ DNS-molekula.

5. lépés: Szorzás az előfordulások számával. 3 × 1,52 × 10¹³ ≈ 4,56 × 10¹³, vagyis körülbelül 45 621 212 121 212 példány.

Ez a szám nagynak tűnik, mert egy 20 μL térfogatú, 10 ng/μL koncentrációjú minta még mindig több billió rövid DNS-molekulát tartalmaz. A valódi mintákban általában sokkal hosszabb szekvenciákat használnak, ami azonos tömeg mellett csökkenti a molekulák számát.

A DNS-kópiaszám-elemzés alkalmazási területei

Daganatdiagnosztika. A patológiai laboratóriumok az emlődaganatok szövetében ellenőrzik a HER2 kópiaszámát. Egy normális sejt két példányt tartalmaz. Egy amplifikált daganatsejt hat vagy több példányt is tartalmazhat, ami befolyásolja a célzott gyógyszerek, például a trasztuzumab alkalmazhatóságát.

Genetikai betegségek vizsgálata. Az olyan állapotok, mint a DiGeorge-szindróma, egy kromoszómaszakasz deléciójával járnak. A Down-szindróma a 21-es kromoszóma egy további példányával jár (21-es triszómia). A példányszám meghatározása segít megerősíteni ezeket a diagnózisokat.

Transzgének és plazmidok mennyiségi meghatározása. A kutatók azt vizsgálják, hogy egy beillesztett gén hány példányban került be egy növényi, állati vagy bakteriális sejtbe. Általában egyetlen példány az előnyös, mert több példány arra késztetheti a sejtet, hogy elhallgattassa a gént.

Kórokozók és a vírusterhelés nyomon követése. A kópiaszám becslése megmutatja, hogy egy mintában mennyi virális vagy bakteriális DNS van jelen; ezt fertőzések nyomon követésére és környezeti vizsgálatokban használják.

A kópiaszám mérésének egyéb módszerei

Ez a kalkulátor gyors becslést ad a szekvencia- és koncentrációs adatok alapján. A nagyobb pontosságot igénylő laboratóriumok jellemzően az alábbi módszerek egyikét használják:

• Kvantitatív polimeráz-láncreakció (qPCR): valós időben amplifikálja és méri a DNS-t; jó kalibrációs görbe esetén körülbelül 15–20% pontosságú.
• Digitális PCR (dPCR): a mintát több ezer apró reakcióra osztja a közvetlen számlálás érdekében, kalibrációs görbe nélkül.
• Fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH): mikroszkóp alatt, közvetlenül a sejteken vagy kromoszómákon jeleníti meg és számolja meg a szekvenciákat; számos daganatdiagnosztikai laboratóriumban ez a standard módszer.
• Következő generációs szekvenálás (NGS): a teljes mintát megszekvenálja, és egyszerre feltérképezi a kópiaszámot az egész genomban.

Gyakran ismételt kérdések

Mi a DNS-kópiaszám? Egy adott DNS-szekvencia előfordulásainak száma egy genomban vagy mintában. A legtöbb emberi gén két példányban található meg, egy-egy példányban mindkét szülőtől. A többlet- vagy hiánypéldányok hatással lehetnek az egészségre és a betegségek kockázatára.

Mennyire pontos ez a kalkulátor? A megadott bemeneti adatok alapján elméleti becslést ad, nem laboratóriumi mérési eredményt. A pontosság attól függ, milyen pontosan mérték meg a koncentrációt, és mennyire specifikus a célzott szekvencia. Közzétett eredményekhez az olyan módszerek, mint a digitális PCR, pontosabbak.

Használható ez a kalkulátor RNS-hez? Nem. Az RNS timin helyett uracilt, valamint másfajta cukrot használ, ezért eltér a molekulatömege a DNS-étől. Az RNS átlagos molekulatömege nukleotidonként körülbelül 330 g/mol, míg a DNS egy bázispárjára vetítve körülbelül 660 g/mol. A DNS-képlet RNS-adatokra alkalmazva hibás eredményt adna.

Miért számítjuk többször az átfedő szekvenciát? A kalkulátor minden olyan pozíciót megszámol, ahol a célzott szekvencia egyezik, még akkor is, ha az egyezések közös betűket tartalmaznak. Az ATATAT szekvenciában az ATA kétszer egyezik: az 1. és a 3. pozíciónál, mert minden kezdőpozíciót külön ellenőriz.

Milyen DNS-koncentrációtartomány működik a legjobban? A 10–100 ng/μL koncentrációk adják a legmegbízhatóbb leolvasást a szokásos laboratóriumi műszerekkel. 10 ng/μL alatt nő a mérési hiba, ezért a hagyományos spektrofotométer helyett érzékenyebb módszer, például fluorométer használata ajánlott.

Megbecsülhető ezzel a kalkulátorral a plazmid kópiaszáma? Igen. A teljes plazmidszekvenciát adja meg DNS-szekvenciaként, a beillesztett szakasz egyedi régióját pedig célzott szekvenciaként, a mért plazmidkoncentrációval és a minta térfogatával együtt.