Fehérje Koncentráció Kalkulátor | A280 mg/mL-re

Fehérjekoncentráció-kalkulátor

A fehérjekoncentráció-kalkulátor a spektrofotométerrel mért fényabszorbanciát az oldatban oldott fehérje mennyiségévé alakítja át. Az eredményt általában milligramm/milliliterben (mg/mL) vagy mikrogramm/milliliterben (μg/mL) adják meg. A számítás a Beer–Lambert-törvényen alapul, amely a kémiában azt írja le, hogyan függ össze a minta által elnyelt fény mennyisége a benne lévő anyag mennyiségével.

A fehérjekoncentráció mérése

A legtöbb fehérje erősen elnyeli az ultraibolya fényt 280 nanométeres (nm) hullámhosszon. Ezt az abszorpciót főként a fehérje szerkezetében található két aminosav, a triptofán és a tirozin okozza. A spektrofotométer fényt bocsát át a mintán, és méri, hogy abból mennyit nyel el a minta. Ezt a mérést abszorbanciának, illetve 280 nm-en végzett mérés esetén A280-nak nevezik.

Az abszorbancia mérése 280 nm-en gyors, és nem semmisíti meg a mintát. Ez különbözteti meg az alább ismertetett kémiai módszerektől, például a Bradford- és a BCA-vizsgálattól. A módszer tisztított, oldatban lévő fehérje esetén működik a legjobban, ha az abszorbancia értéke körülbelül 0,1 és 1,0 között van. Az ezen a tartományon kívüli mérések kevésbé megbízhatók, ezért a mintát gyakran fel kell hígítani a mérés előtt.

A fehérjekoncentráció képlete

A kalkulátor a Beer–Lambert-törvényt a koncentráció kiszámítására rendezi át:

C = (A × DF) / (ε × l)

• C — a fehérje koncentrációja mg/mL-ben
• A — az abszorbancia 280 nm-en (mértékegység nélküli szám)
• DF — a hígítási tényező, vagyis hogy az eredeti mintát hányszorosára hígították a mérés előtt
• ε — az extinkciós együttható, a fehérjére jellemző állandó, L/(g·cm) mértékegységben
• l — az optikai úthossz, vagyis a fény által a mintában megtett távolság, cm-ben (szabványos küvettában általában 1 cm; a küvetta a spektrofotométerben használt kis üveg- vagy műanyag edény)

Az eredmény mikrogramm/milliliterre való átszámításához a mg/mL-ben kapott értéket meg kell szorozni 1 000-val. A mintában lévő fehérje teljes tömegének meghatározásához a koncentrációt meg kell szorozni a minta milliliterben megadott térfogatával.

Számítási példa

Egy minta abszorbanciája 0,5 volt 280 nm-en. Nem hígították, ezért a hígítási tényező 1, és szabványos, 1 cm-es küvettában mérték. A fehérje szarvasmarha-szérumalbumin (BSA), amelynek extinkciós együtthatója 0,667 L/(g·cm).

C = (0,5 × 1) / (0,667 × 1) ≈ 0,75 mg/mL

Egy 1 mL-es mintában ez körülbelül 0,75 mg teljes fehérjét, azaz 750 μg/mL-t jelent.

Gyakori fehérjék extinkciós együtthatói

Minden fehérje eltérő módon nyeli el a fényt, mivel különböző számú triptofán- és tirozinmaradékot tartalmaz. Az extinkciós együttható egy adott fehérje jellemzőjét írja le 280 nm-en, L/(g·cm) mértékegységben. A gyakran használt értékek közé tartoznak a következők:

A kalkulátor egyedi extinkciós együtthatót is elfogad olyan fehérjéhez, amely nem szerepel ezen a listán. Ismert aminosav-szekvenciájú fehérje esetén ez az érték a Gill és von Hippel által 1989-ben közzétett képlettel becsülhető meg: ε₂₈₀ = (triptofánmaradékok száma × 5 500) + (tirozinmaradékok száma × 1 490) + (cisztinmaradékok száma × 125). Ez a képlet M⁻¹cm⁻¹-ben adja meg az eredményt, amely moláris mértékegység, és eltér a fent megadott, tömegen alapuló L/(g·cm) értékektől. Az ExPASy szerver által üzemeltetett, ingyenesen használható eszközök, például a ProtParam, közvetlenül kiszámítják ezt az értéket a fehérjeszekvenciából.

Optikai úthossz és hígítási tényező

Az optikai úthossz a mintát tartó küvetta szélessége, centiméterben mérve. A szabványos küvetták szélessége 1 cm. A nagyon kis mintákat mérő mikrovolumenes spektrofotométerek ennél jóval rövidebb úthosszt, például 0,1 cm-t is használhatnak.

A hígítási tényező figyelembe veszi a mérés előtt végzett hígítást. Ha egy tömény minta abszorbanciája meghaladná az 1,0 értéket, gyakran először pufferrel hígítják. A hígítási tényező a hígított teljes térfogat és az eredeti mintatérfogat hányadosa. Például 10 μL minta 990 μL pufferrel való összekeverése 1 000 μL teljes térfogatot és 100 hígítási tényezőt eredményez.

A fehérjekoncentráció mérésének egyéb módszerei

Az abszorbancia 280 nm-en a laboratóriumban alkalmazott több gyakori módszer egyike.

• Bradford-vizsgálat: olyan festéket használ, amely a fehérjéhez kötődve megváltoztatja a színét. Tisztítatlan mintákon is jól működik, de a színváltozás különböző fehérjék esetén eltérő lehet.
• BCA-vizsgálat: a fehérje peptidkötései által kiváltott színváltozáson alapul. Számos detergenssel kompatibilis, de hosszabb ideig tart, mint a közvetlen abszorbanciamérés.
• Lowry-módszer: régebbi, igen érzékeny módszer, amely azonban rosszul reagál néhány gyakori puffertartalomra.

Mindhárom módszer megsemmisíti a mintát. A közvetlen A280-mérés nem, így ugyanaz a minta visszanyerhető és újra felhasználható.

Gyakran ismételt kérdések

Mekkora az ideális abszorbanciatartomány ennél a módszernél?

0,1 és 1,0 között. 0,1 alatt a mérés pontatlan. 1,0 felett az abszorbancia és a koncentráció közötti kapcsolat már nem feltétlenül lineáris, ezért a mintát először fel kell hígítani.

Miért 280 nm-en mérnek 260 nm helyett?

A nukleinsavak, például a DNS és az RNS, erősen elnyelik a fényt 260 nm-en. A fehérjék a triptofán- és tirozin-tartalmuk miatt jobban abszorbeálnak 280 nm-en. A 280 nm-en végzett mérés csökkenti a mintában jelen lévő nukleinsavak okozta interferenciát.

Hogyan lehet meghatározni a listán nem szereplő fehérje extinkciós együtthatóját?

Ismert szekvenciájú fehérje esetén egy ProtParamhoz hasonló eszköz a triptofán-, tirozin- és cisztinmaradékok száma alapján számítja ki. A koncentráció közvetlenül is meghatározható a minta abszorbanciájának ismert koncentrációjú oldat abszorbanciájával való összehasonlításával.

Működik ez a módszer fehérjék keveréke esetén is?

Egyetlen, tisztított, ismert extinkciós együtthatójú fehérje esetén működik a legjobban. Ismeretlen fehérjék keverékét, például sejtlizátumot, általában inkább Bradford- vagy BCA-vizsgálattal mérnek, mivel ezek a módszerek következetesebb becslést adnak a teljes fehérjemennyiségre.

Befolyásolhatják a detergensek a mérést?

Igen. Számos detergens elnyeli a fényt 280 nm közelében, ami torzíthatja az eredményt. Az azonos detergenskoncentrációt tartalmazó vakminta használata segít kiküszöbölni ezt a háttérabszorbanciát. Nagyon magas detergenskoncentráció esetén inkább detergensekkel kompatibilis vizsgálatra, például BCA-módszerre lehet szükség.