qPCR Hatásfok Kalkulátor: Standard Görbe Elemző Eszköz

qPCR-hatékonyság-kalkulátor

A qPCR-hatékonyság-kalkulátor megbecsüli, hogy egy kvantitatív PCR- (qPCR-) reakció milyen hatékonyan másolja a cél-DNS-szekvenciát minden amplifikációs ciklusban. Hígítási sorozatból származó Ct-értékeket használ (azt a ciklusszámot, amelynél a fluoreszcens jel átlépi a beállított küszöbértéket) a hatékonyság, a meredekség, a tengelymetszet és az R² kiszámításához.

Mi a qPCR hatékonysága?

A kvantitatív PCR ciklusról ciklusra követi a fluoreszcenciát, miközben a reakció másolja a cél-DNS-szekvenciát. Az amplifikációs hatékonyság azt írja le, hogy a cél-DNS mennyisége mennyivel nő az egyes ciklusokban. 100%-os hatékonyságnál a cél-DNS mennyisége minden ciklusban megduplázódik.

A valós reakciók ritkán érik el pontosan a 100%-ot. A legtöbb laboratórium a 90% és 110% közötti hatékonyságot tekinti elfogadhatónak a megbízható kvantifikáláshoz. A 90% alatti vagy 110% feletti érték problémára utalhat, például nem megfelelő primertervezésre, a minta kivonásából visszamaradt PCR-inhibitorokra vagy a hígítási sorozat pipettázási hibáira.

A hatékonyság leginkább a génexpresszió minták közötti összehasonlításakor számít. A hajtásváltozás kiszámítására használt szokásos ΔΔCt-módszer azt feltételezi, hogy minden reakció 100%-os hatékonysággal zajlik. Ha a mért hatékonyság eltér a 100%-tól, vagy ha a célgén és a referencia gén hatékonysága különbözik, a hajtásváltozás eredményei pontatlanok lehetnek.

qPCR-hatékonysági képlet

A hatékonyságot a standard görbe meredekségéből számítják ki. Ez a hígítási sorozat kiindulási DNS-mennyiségének 10 alapú logaritmusával (log10) szemben ábrázolt Ct-értékekből illesztett egyenes.

E = 10^(-1/meredekség) - 1

Az E a hatékonyság, decimális formában kifejezve (százalékos értékhez szorozza meg 100-zal). A meredekség a standard görbe egyenesének meredeksége. Negatív, mert a Ct nő, ahogy a kiindulási DNS mennyisége csökken.

A -3,32 meredekség 100%-os hatékonyságnak felel meg:

10^(-1/-3,32) - 1 = 10^0,301–1 ≈ 1,00

Ez azért adódik, mert egy 10-szeres hígításnak körülbelül 3,32 ciklussal kell eltolnia a Ct-t, ha a reakció minden ciklusban megduplázza a DNS mennyiségét, mivel a log2(10) megközelítőleg 3,32.

A gyakorlatban a -3,1 és -3,6 közötti meredekséget tekintik elfogadhatónak. Ez nagyjából 90%–110%-os hatékonyságnak felel meg. Az -3,1-hez közelebbi meredekség magasabb számított hatékonyságot ad; az -3,6-hoz közelebbi meredekség alacsonyabbat.

A qPCR-hatékonyság kiszámítása: a standardgörbe-módszer

1. Készítsen hígítási sorozatot. A legkoncentráltabb mintával kezdve hígítsa azt minden következő mintánál rögzített faktorral, általában 10-szeresére. Végezzen qPCR-t minden hígításon, és rögzítse a Ct-értékét.
2. Alakítsa át az egyes hígításokat log10-értékké. Az első, legkoncentráltabb mintát 0 pozícióként véve az i sorszámú minta log10(relatív mennyiség) értéke -i × log10(hígítási faktor).
3. Ábrázolja minden hígításnál a Ct-t (függőleges tengely) a log10-értékkel szemben (vízszintes tengely), majd végezzen lineáris regressziót.
4. Olvassa le a regressziós egyenes meredekségét, tengelymetszetét és R² értékét.
5. Helyettesítse be a meredekséget az E = 10^(-1/meredekség) - 1 képletbe a hatékonyság meghatározásához.

A standard görbe minőségi kritériumai

• Legalább 0,98 értékű R². Ez azt méri, hogy a pontok milyen szorosan illeszkednek egy egyeneshez. Az alacsonyabb érték gyakran pipettázási hibára vagy inkonzisztens amplifikációra utal.
• A meredekség -3,1 és -3,6 között legyen. Ez a tartomány 90–110%-os hatékonyságnak felel meg.
• Legalább három hígítási pont. Öt vagy hat pont megbízhatóbb egyenest ad, és könnyebbé teszi a kiugró érték felismerését.
• A legkoncentráltabb minta Ct-értékének körülbelül 15-20-nak kell lennie. A leghígabb minta Ct-értéke maradjon 35 alatt, mivel az ennél nagyobb értékek megközelítik a kimutatási határt.

Megoldott példa

Egy ötpontos, 10-szeres hígítási sorozat Ct-értékei a legkoncentráltabbtól a leghígabbig: 15,0, 18,5, 22,0, 25,5, 29,0.

A log10(relatív mennyiség) értékei 0, -1, -2, -3, -4, mivel minden hígítási lépés -log10(10), azaz -1 értékkel változtatja az értéket. A Ct minden lépésben 3,5 ciklussal nő, ezért a pontok egy egyenesre esnek, és a lineáris regresszió eredménye:

• Meredekség: -3,5
• Tengelymetszet: 15,0
• R²: 1,0

Hatékonyság: E = 10^(-1/-3,5) - 1 = 10^0,286–1 ≈ 0,931, vagyis körülbelül 93%.

A 93%-os hatékonyság és az R² = 1,0 megfelel a standard minőségi kritériumoknak, és alkalmas génexpresszió kvantifikálására.

Kódpélda

Ez a JavaScript-függvény ugyanazt a módszert követi, mint a kalkulátor. Minden Ct-érték indexét negálja a logaritmus képzése előtt, mert az első, legkoncentráltabb minta relatív mennyisége a legnagyobb, és minden későbbi minta hígabb.

1function qpcrEfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
2  // Sample 0 is most concentrated; each later sample is diluted further,
3  // so its log10(relative quantity) is negative.
4  const x = ctValues.map((_, i) => -i * Math.log10(dilutionFactor));
5  const n = ctValues.length;
6  let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0;
7  for (let i = 0; i < n; i++) {
8    sumX += x[i];
9    sumY += ctValues[i];
10    sumXY += x[i] * ctValues[i];
11    sumXX += x[i] * x[i];
12  }
13  const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
14  const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
15  const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
16  return { efficiency, slope, intercept };
17}
18
19qpcrEfficiency([15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0], 10);
20// => { efficiency: 93.07, slope: -3.5, intercept: 15 }
21

Miért fontos a hatékonyság a génexpresszió szempontjából?

A hajtásváltozás számításai, köztük a ΔΔCt-módszer, azt feltételezik, hogy minden reakció minden ciklusban megduplázza a célgén mennyiségét. Ha a célgén és a referencia gén mért hatékonysága különbözik, az egyszerű ΔΔCt-képlet hibát vezet be. A kutatók gyakran hatékonyság-korrigált számításra, például a Michael Pfaffl által 2001-ben leírt módszerre váltanak, ha a hatékonyságok körülbelül öt százalékpontnál nagyobb mértékben térnek el. A 2009-ben közzétett MIQE-irányelvek, a qPCR-re vonatkozó, széles körben idézett jelentési szabványok, azt javasolják, hogy a tanulmányok a kvantifikálási eredmények mellett közöljék a számított hatékonyságot, a meredekséget és az R² értékét is.

Gyakran ismételt kérdések

Mekkora a jó qPCR-hatékonyság százalékos értéke?

Általában a 90% és 110% közötti érték elfogadott; a jól optimalizált vizsgálatok eredménye általában 95–105%. A -3,32 meredekség pontosan 100%-os hatékonyságnak felel meg.

Miért magasabb a qPCR-hatékonyságom 110%-nál?

Gyakori ok a hígítási sorozat pipettázási hibája, a primer-dimerek, a koncentrált és híg mintákat eltérően befolyásoló inhibitorok, illetve az amplifikáció exponenciális szakaszán kívül beállított fluoreszcenciaküszöb. Az egynél több csúcsot tartalmazó olvadási görbe primer-dimerek jelenlétére utalhat.

Miért alacsonyabb a qPCR-hatékonyságom 90%-nál?

Valószínű ok a nem megfelelő primertervezés, a minta kivonásából visszamaradt PCR-inhibitor vagy a nem optimális annealing-hőmérséklet. A primer-specificitás ellenőrzése és hőmérséklet-gradiens futtatása segíthet megtalálni az okot.

Mit jelent az alacsony R²-érték?

Az R² azt méri, hogy a Ct-értékek milyen jól illeszkednek egy logaritmikus mennyiséggel szembeni egyeneshez. A 0,98 alatti érték pipettázási inkonzisztenciára, inhibitorral szennyezett mintára vagy a kimutatási határhoz közeli hígítási pontra utalhat.

Hány hígítási pont szükséges a standard görbéhez?

Legalább három, ennyi szükséges a lineáris regresszióhoz. Öt vagy hat pont megbízhatóbb meredekséget ad, és könnyebbé teszi a kiugró értékek felismerését.

Változhat a hatékonyság a kísérletek között?

Igen. Egy új reagenslot, egy új primerkészlet, más mintatípus vagy eltérő qPCR-készülék módosíthatja a hatékonyságot. Sok laboratórium néhány havonta vagy minden új reagenslot esetén újra ellenőrzi a hatékonyságot.

Hivatkozások

1. Bustin SA, Benes V, Garson JA és mtsai. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 2009;55(4):611-622.
2. Pfaffl MW. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 2001;29(9):e45.
3. Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. Mennyire pontos a PCR-hatékonyság becslése: ajánlások a qPCR-hatékonyság pontos és megbízható értékeléséhez. Biomolecular Detection and Quantification. 2015;3:9-16.