Számítsa ki a PCR hatékonyságát a Ct értékek és hígítási tényezők alapján. Elemezze a standard görbéket, határozza meg az amplifikációs hatékonyságot, és érvényesítse kvantitatív PCR kísérleteit.
Az értéknek pozitívnak kell lennie
Az értéknek pozitívnak kell lennie
Az értéknek pozitívnak kell lennie
Az értéknek pozitívnak kell lennie
Az értéknek pozitívnak kell lennie
Adjon meg érvényes adatokat a diagram generálásához
A qPCR hatékonyság a PCR reakció teljesítményének mértéke. A 100%-os hatékonyság azt jelenti, hogy a PCR termék mennyisége minden ciklusban megduplázódik a exponenciális fázis során.
A hatékonyságot a standard görbe meredeksége alapján számítják ki, amelyet a Ct értékek ábrázolásával nyernek a kezdeti sablon koncentráció (hígítási sorozat) logaritmusával szemben.
A hatékonyság (E) a következő képlettel számítható:
E = 10^(-1/slope) - 1
A Kvantitatív Polimeráz Láncreakció (qPCR) hatékonysága kritikus paraméter, amely közvetlen hatással van a qPCR kísérletek pontosságára és megbízhatóságára. A qPCR hatékonysági kalkulátor segít a kutatóknak meghatározni, hogy a PCR reakcióik mennyire hatékonyan amplifikálják a cél DNS szekvenciákat minden egyes hőmérsékleti ciklus során. Az ideális qPCR reakcióknak 90-110% közötti hatékonysággal kell rendelkezniük, ami azt jelzi, hogy a PCR termék mennyisége körülbelül megduplázódik minden ciklus során az exponenciális fázisban.
A gyenge amplifikációs hatékonyság pontatlan mennyiségi meghatározáshoz, megbízhatatlan eredményekhez és hibás kísérleti következtetésekhez vezethet. A qPCR hatékonyságának kiszámításával és nyomon követésével optimalizálhatja a reakciós körülményeket, érvényesítheti a primer tervezést, és biztosíthatja a kvantitatív PCR adatok minőségét.
Ez a kalkulátor a standard görbe módszert használja, amely a ciklus küszöbérték (Ct) értékeket ábrázolja a sablon koncentrációjának logaritmusával (sorozatos hígításokkal) szemben, hogy meghatározza a qPCR vizsgálat hatékonyságát. A standard görbe eredményeként kapott lejtőjét ezután egy egyszerű matematikai képlet segítségével használják a PCR amplifikációs hatékonyságának kiszámítására.
A qPCR reakció hatékonysága a standard görbe lejtőjéből számítható ki a következő képlettel:
Ahol:
Egy ideális PCR reakció esetén, 100% hatékonysággal (tökéletes amplikon duplázódás minden ciklusban), a lejtő -3,32 lenne. Ez azért van, mert:
10^{(-1/-3.32)} - 1 = 10^{0.301} - 1 = 2 - 1 = 1.0 \text{ (vagy 100%)}
A hatékonysági százalékot a tizedes hatékonyság 100-zal való szorzásával számítják ki:
\text{Hatékonyság (%)} = E \times 100\%
A standard görbe úgy jön létre, hogy a Ct értékeket (y-tengely) ábrázolják a kezdeti sablon koncentrációjának vagy hígítási tényezőjének logaritmusával (x-tengely). E két változó közötti kapcsolatnak lineárisnak kell lennie, és ennek a lineáris kapcsolatnak a minőségét a meghatározás együtthatójával (R²) értékeljük.
A megbízható qPCR hatékonysági számításokhoz:
Adatok előkészítése: A kalkulátor a Ct értékeket minden hígítási pontra és a hígítási tényezőt bemenetként veszi.
Logaritmikus átalakítás: A hígítási sorozat logaritmikus skálára (10-es alapú logaritmus) van átalakítva.
Lineáris regresszió: A kalkulátor lineáris regressziós elemzést végez a log-transzformált adatokon, hogy meghatározza a lejtőt, az y-tengelymetszetet és az R² értéket.
Hatékonyság számítása: A lejtőérték felhasználásával a hatékonyságot a képlet E = 10^(-1/slope) - 1 segítségével számítják ki.
Eredmények értelmezése: A kalkulátor megjeleníti a hatékonyságot százalékban, a lejtőt és az R² értéket, hogy segítsen értékelni a qPCR vizsgálat megbízhatóságát.
Kövesse ezeket a lépéseket a qPCR hatékonyságának kiszámításához:
Állítsa be a hígítások számát: Válassza ki, hány hígítási pontja van a standard görbében (ajánlott 3-7 pont).
Adja meg a hígítási tényezőt: Írja be a hígítási tényezőt, amelyet a következő minták között használt (pl. 10 egy 10-szeres hígítási sorozat esetén, 5 egy 5-szörös hígítási sorozat esetén).
Írja be a Ct értékeket: Adja meg a Ct értékeket minden hígítási pontra. Tipikusan az első hígítás (Hígítás 1) tartalmazza a legmagasabb koncentrációjú sablont, ami a legalacsonyabb Ct értéket eredményezi.
Nézze meg az eredményeket: A kalkulátor automatikusan kiszámítja és megjeleníti:
Értelmezze az eredményeket: Értékelje, hogy a qPCR hatékonysága az elfogadható tartományon belül van-e (90-110%), és hogy az R² érték megbízható standard görbét jelez-e (≥ 0,98).
Másolja az eredményeket: Használja a "Eredmények másolása" gombot, hogy másolja az összes kiszámított értéket a nyilvántartásához vagy publikációihoz.
Nézzünk meg egy példát:
Amikor a standard görbén ábrázolják:
A kalkulátor elvégzi a lineáris regressziót és meghatározza:
A hatékonyság képletének használatával:
Ez 93%-os jó qPCR hatékonyságot jelez, amely az elfogadható 90-110% tartományon belül van.
Mielőtt új primer párt használna kvantitatív kísérletekhez, elengedhetetlen annak teljesítményének érvényesítése. A qPCR hatékonyságának kiszámítása segít:
Új qPCR vizsgálatok fejlesztésekor a hatékonysági számítások kulcsfontosságúak:
A relatív kvantifikálás kísérletek során a PCR hatékonyság ismerete elengedhetetlen:
Klinikai és diagnosztikai környezetben a qPCR hatékonyság fontos a következők szempontjából:
Környezetvédelmi és élelmiszerbiztonsági alkalmazásokban a hatékonysági számítások segítenek:
Bár a standard görbe módszer a legelterjedtebb megközelítés a qPCR hatékonyságának kiszámítására, léteznek alternatív módszerek:
Ez a módszer a fluoreszcencia adatokat egyetlen amplifikációs görbéből számítja ki, anélkül, hogy hígítási sorozatra lenne szükség. Az olyan szoftverek, mint a LinRegPCR, az egyes reakciók exponenciális fázisát elemzik a hatékonyság meghatározásához.
Előnyök:
Hátrányok:
A digitális PCR (dPCR) abszolút kvantifikálást biztosít anélkül, hogy standard görbére vagy hatékonysági számításokra lenne szükség.
Előnyök:
Hátrányok:
Néhány qPCR elemző szoftver olyan összehasonlító kvantifikálási módszereket kínál, amelyek becslik a hatékonyságot anélkül, hogy teljes standard görbére lenne szükség.
Előnyök:
Hátrányok:
A qPCR és a hatékonysági számítások fejlődése az elmúlt néhány évtizedben jelentősen változott:
A Polimeráz Láncreakciót (PCR) Kary Mullis találta fel 1983-ban, forradalmasítva a molekuláris biológiát. Azonban a hagyományos PCR csak kvalitatív vagy félig kvantitatív volt. Az első valós idejű PCR rendszert az 1990-es évek elején fejlesztették ki Russell Higuchi és munkatársai, akik bemutatták, hogy a PCR termékek felhalmozódásának nyomon követése (etidium-bromid fluoreszcencia használatával) kvantitatív információt nyújthat.
Ahogy a qPCR technológia fejlődött, a kutatók felismerték a standardizálás és az érvényesítés fontosságát. A PCR hatékonyság fogalma központi szerepet játszott a megbízható kvantifikálásban:
A terület tovább fejlődött:
Ma a qPCR hatékonyságának kiszámítása és jelentése elengedhetetlen a megbízható qPCR adatok publikálásához, és az ilyen kalkulátorok segítenek a kutatóknak a legjobb gyakorlatok betartásában a területen.
1' Excel képlet a qPCR hatékonyságának kiszámításához a lejtőből
2' Helyezze a B2 cellába, ha a lejtő az A2 cellában van
3=10^(-1/A2)-1
4
5' Excel képlet a hatékonyság százalékra való átváltásához
6' Helyezze a C2 cellába, ha a tizedes hatékonyság a B2 cellában van
7=B2*100
8
9' Funkció a hatékonyság kiszámítására Ct értékek és hígítási tényező alapján
10Function qPCR_Efficiency(CtValues As Range, DilutionFactor As Double) As Double
11 Dim i As Integer
12 Dim n As Integer
13 Dim sumX As Double, sumY As Double, sumXY As Double, sumXX As Double
14 Dim logDilution As Double, slope As Double
15
16 n = CtValues.Count
17
18 ' Lineáris regresszió kiszámítása
19 For i = 1 To n
20 logDilution = (i - 1) * WorksheetFunction.Log10(DilutionFactor)
21 sumX = sumX + logDilution
22 sumY = sumY + CtValues(i)
23 sumXY = sumXY + (logDilution * CtValues(i))
24 sumXX = sumXX + (logDilution * logDilution)
25 Next i
26
27 ' Lejtő kiszámítása
28 slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX)
29
30 ' Hatékonyság kiszámítása
31 qPCR_Efficiency = (10 ^ (-1 / slope) - 1) * 100
32End Function
331# R funkció a qPCR hatékonyságának kiszámítására Ct értékek és hígítási tényező alapján
2calculate_qpcr_efficiency <- function(ct_values, dilution_factor) {
3 # Log hígítási értékek létrehozása
4 log_dilutions <- log10(dilution_factor) * seq(0, length(ct_values) - 1)
5
6 # Lineáris regresszió végrehajtása
7 model <- lm(ct_values ~ log_dilutions)
8
9 # Lejtő és R-négyzet kinyerése
10 slope <- coef(model)[2]
11 r_squared <- summary(model)$r.squared
12
13 # Hatékonyság kiszámítása
14 efficiency <- (10^(-1/slope) - 1) * 100
15
16 # Eredmények visszaadása
17 return(list(
18 efficiency = efficiency,
19 slope = slope,
20 r_squared = r_squared,
21 intercept = coef(model)[1]
22 ))
23}
24
25# Példa használat
26ct_values <- c(15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0)
27dilution_factor <- 10
28results <- calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
29cat(sprintf("Hatékonyság: %.2f%%\n", results$efficiency))
30cat(sprintf("Lejtő: %.4f\n", results$slope))
31cat(sprintf("R-négyzet: %.4f\n", results$r_squared))
321import numpy as np
2from scipy import stats
3import matplotlib.pyplot as plt
4
5def calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor):
6 """
7 Kiszámítja a qPCR hatékonyságát Ct értékek és hígítási tényező alapján.
8
9 Paraméterek:
10 ct_values (list): Ct értékek listája
11 dilution_factor (float): Hígítási tényező a következő minták között
12
13 Visszatér:
14 dict: Szótár, amely tartalmazza a hatékonyságot, a lejtőt, az r_négyzetet és az interceptet
15 """
16 # Log hígítási értékek létrehozása
17 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
18
19 # Lineáris regresszió végrehajtása
20 slope, intercept, r_value, p_value, std_err = stats.linregress(log_dilutions, ct_values)
21
22 # Hatékonyság kiszámítása
23 efficiency = (10 ** (-1 / slope) - 1) * 100
24 r_squared = r_value ** 2
25
26 return {
27 'efficiency': efficiency,
28 'slope': slope,
29 'r_squared': r_squared,
30 'intercept': intercept
31 }
32
33def plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results):
34 """
35 Ábrázolja a standard görbét a regressziós vonallal.
36 """
37 log_dilutions = np.log10(dilution_factor) * np.arange(len(ct_values))
38
39 plt.figure(figsize=(10, 6))
40 plt.scatter(log_dilutions, ct_values, color='blue', s=50)
41
42 # Regressziós vonal generálása
43 x_line = np.linspace(min(log_dilutions) - 0.5, max(log_dilutions) + 0.5, 100)
44 y_line = results['slope'] * x_line + results['intercept']
45 plt.plot(x_line, y_line, 'r-', linewidth=2)
46
47 plt.xlabel('Log Hígítás')
48 plt.ylabel('Ct Érték')
49 plt.title('qPCR Standard Görbe')
50
51 # Egyenlet és R² hozzáadása az ábrához
52 equation = f"y = {results['slope']:.4f}x + {results['intercept']:.4f}"
53 r_squared = f"R² = {results['r_squared']:.4f}"
54 efficiency = f"Hatékonyság = {results['efficiency']:.2f}%"
55
56 plt.annotate(equation, xy=(0.05, 0.95), xycoords='axes fraction')
57 plt.annotate(r_squared, xy=(0.05, 0.90), xycoords='axes fraction')
58 plt.annotate(efficiency, xy=(0.05, 0.85), xycoords='axes fraction')
59
60 plt.grid(True, linestyle='--', alpha=0.7)
61 plt.tight_layout()
62 plt.show()
63
64# Példa használat
65ct_values = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0]
66dilution_factor = 10
67results = calculate_qpcr_efficiency(ct_values, dilution_factor)
68
69print(f"Hatékonyság: {results['efficiency']:.2f}%")
70print(f"Lejtő: {results['slope']:.4f}")
71print(f"R-négyzet: {results['r_squared']:.4f}")
72print(f"Intercept: {results['intercept']:.4f}")
73
74# Standard görbe ábrázolása
75plot_standard_curve(ct_values, dilution_factor, results)
761/**
2 * Kiszámítja a qPCR hatékonyságát Ct értékek és hígítási tényező alapján
3 * @param {Array<number>} ctValues - Ct értékek tömbje
4 * @param {number} dilutionFactor - Hígítási tényező a következő minták között
5 * @returns {Object} Szótár, amely tartalmazza a hatékonyságot, a lejtőt, az r_négyzetet és az interceptet
6 */
7function calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
8 // Log hígítási értékek létrehozása
9 const logDilutions = ctValues.map((_, index) => index * Math.log10(dilutionFactor));
10
11 // Lineáris regresszióhoz szükséges átlagok kiszámítása
12 const n = ctValues.length;
13 let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0, sumYY = 0;
14
15 for (let i = 0; i < n; i++) {
16 sumX += logDilutions[i];
17 sumY += ctValues[i];
18 sumXY += logDilutions[i] * ctValues[i];
19 sumXX += logDilutions[i] * logDilutions[i];
20 sumYY += ctValues[i] * ctValues[i];
21 }
22
23 // Lejtő és intercept kiszámítása
24 const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
25 const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
26
27 // R-négyzet kiszámítása
28 const yMean = sumY / n;
29 let totalVariation = 0;
30 let explainedVariation = 0;
31
32 for (let i = 0; i < n; i++) {
33 const yPredicted = slope * logDilutions[i] + intercept;
34 totalVariation += Math.pow(ctValues[i] - yMean, 2);
35 explainedVariation += Math.pow(yPredicted - yMean, 2);
36 }
37
38 const rSquared = explainedVariation / totalVariation;
39
40 // Hatékonyság kiszámítása
41 const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
42
43 return {
44 efficiency,
45 slope,
46 rSquared,
47 intercept
48 };
49}
50
51// Példa használat
52const ctValues = [15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0];
53const dilutionFactor = 10;
54const results = calculateQPCREfficiency(ctValues, dilutionFactor);
55
56console.log(`Hatékonyság: ${results.efficiency.toFixed(2)}%`);
57console.log(`Lejtő: ${results.slope.toFixed(4)}`);
58console.log(`R-négyzet: ${results.rSquared.toFixed(4)}`);
59console.log(`Intercept: ${results.intercept.toFixed(4)}`);
60A jó qPCR hatékonyság tipikusan 90% és 110% (0,9-1,1) között van. A 100%-os hatékonyság a PCR termék tökéletes megduplázódását jelenti minden ciklusban. Az ezen tartományon kívüli hatékonyságok problémákat jelezhetnek a primer tervezésével, a reakciós körülményekkel vagy a gátló anyagok jelenlétével kapcsolatban.
A 100% feletti hatékonyságok előfordulhatnak:
Az alacsony R² érték (0,98 alatt) gyenge linearitást sugall a standard görbében, amelyet a következők okozhatnak:
A megbízható hatékonysági számításokhoz legalább 3 hígítási pontra van szükség, de 5-6 pont ajánlott a pontosabb eredmények érdekében. Ezeknek a pontoknak a vizsgálati minták várható koncentrációjának teljes dinamikus tartományát kell lefedniük.
A relatív kvantifikálás ΔΔCt módszerében egyenlő hatékonyságok feltételezése (ideálisan 100%) között a cél- és referencia gének esetében elengedhetetlen. Ha a hatékonyságok jelentősen eltérnek:
Nem, a hatékonyságot minden primer párra meg kell határozni, és újra kell érvényesíteni:
A PCR gátlók:
A kifejezéseket gyakran felcserélhetően használják, de:
A qPCR hatékonyságának javításához:
A jelentősen eltérő hatékonyságú minták összehasonlítása nem ajánlott, mert:
Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. A MIQE irányelvek: minimális információ a kvantitatív valós idejű PCR kísérletek publikálásához. Clin Chem. 2009;55(4):611-622. doi:10.1373/clinchem.2008.112797
Pfaffl MW. Egy új matematikai modell a relatív kvantifikáláshoz valós idejű RT-PCR-ben. Nucleic Acids Res. 2001;29(9):e45. doi:10.1093/nar/29.9.e45
Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. Mennyire jó a PCR hatékonyság becslése: Ajánlások a pontos és megbízható qPCR hatékonysági értékelésekhez. Biomol Detect Quantif. 2015;3:9-16. doi:10.1016/j.bdq.2015.01.005
Taylor SC, Nadeau K, Abbasi M, Lachance C, Nguyen M, Fenrich J. Az Ultimate qPCR Kísérlet: Publikációs Minőségű, Megbízható Adatok Előállítása Elsőre. Trends Biotechnol. 2019;37(7):761-774. doi:10.1016/j.tibtech.2018.12.002
Ruijter JM, Ramakers C, Hoogaars WM, et al. Amplifikációs hatékonyság: a baseline és a bias összekapcsolása a kvantitatív PCR adatok elemzésében. Nucleic Acids Res. 2009;37(6):e45. doi:10.1093/nar/gkp045
Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, Watson R. Kinetikus PCR elemzés: a DNS amplifikációs reakciók valós idejű nyomon követése. Biotechnology (N Y). 1993;11(9):1026-1030. doi:10.1038/nbt0993-1026
Bio-Rad Laboratories. Valós Idejű PCR Alkalmazási Útmutató. https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_5279.pdf
Thermo Fisher Scientific. Valós Idejű PCR Kézikönyv. https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-pcr-handbook.pdf
A qPCR Hatékonysági Kalkulátorunk egyszerű, mégis hatékony eszközt biztosít a kutatók számára, hogy érvényesítsék és optimalizálják kvantitatív PCR kísérleteiket. A standard görbékből származó hatékonyság pontos kiszámításával biztosíthatja a megbízható kvantifikálást, megoldhatja a problémás vizsgálatokat, és betarthatja a legjobb gyakorlatokat a qPCR kísérletezés során.
Próbálja ki kalkulátorunkat még ma, hogy javítsa a qPCR adatai minőségét és megbízhatóságát!
Fedezzen fel több olyan eszközt, amely hasznos lehet a munkafolyamatához