DNS Koncentráció Kalkulátor | A260 - ng/μL Konvertáló

DNS-koncentráció-kalkulátor

A DNS-koncentráció-kalkulátor a 260 nanométeren mért UV-abszorbanciaértéket, az úgynevezett A260-at, DNS-koncentrációvá alakítja, nanogramm per mikroliterben (ng/µL) megadva. A mintában lévő DNS teljes mennyiségét is megadja mikrogrammban (µg).

Mi az A260 abszorbancia?

Az A260 azt az ultraibolya fény mennyiségét jelenti, amelyet egy oldat 260 nanométeres hullámhosszon elnyel. A DNS a nukleotidbázisai miatt ezen a hullámhosszon nyeli el legerősebben az UV-fényt. A spektrofotométer az A260 értékét vakmérés után méri; a háttér-abszorbancia kiküszöböléséhez ugyanazt a puffert használja, mint amelyben a minta van. Minél több DNS van az oldatban, annál magasabb az A260 értéke.

DNS-koncentráció képlete

A kétszálú DNS a koncentrációjával arányosan nyeli el az UV-fényt; ezt az összefüggést Beer–Lambert-törvénynek nevezik. Szabványos, 1 centiméteres fényúton a 1,0 A260 értékű oldat körülbelül 50 ng/µL kétszálú DNS-t tartalmaz. Ez a szám, az átváltási tényező, bármely A260 értéket koncentrációvá alakít:

DNS-koncentráció (ng/µL) = A260 × 50 × hígítási tényező

A hígítási tényező figyelembe veszi a minta mérése előtt végzett hígítást. A hígítás nélkül mért minta hígítási tényezője 1.

A teljes DNS-hozam kiszámítása

A koncentráció ismeretében a mintában lévő DNS teljes tömege a térfogatából határozható meg:

Teljes DNS-mennyiség (µg) = koncentráció (ng/µL) × térfogat (µL) ÷ 1000

A DNS-koncentráció kiszámítása lépésről lépésre

1. Mérés előtt alaposan keverje össze a mintát. A DNS a cső falához tapadhat, vagy egyenetlenül ülepedhet.
2. Hígítsa fel a mintát, ha nagyon koncentrált, és törekedjen 0,1 és 1,0 közötti A260 értékre. A spektrofotométeres mérések ezen a tartományon kívül a legkevésbé megbízhatók.
3. Nullázza a spektrofotométert a hígításhoz használt pufferrel, majd mérje meg a mintát 260 nm-en.
4. Adja meg az A260 értékét, a mintatérfogatot és a hígítási tényezőt a koncentráció és a teljes hozam kiszámításához. Eredmény csak akkor jelenik meg, ha mindhárom mező ki van töltve, és a térfogat nagyobb nullánál.

Megoldott példa

1. példa: hígítatlan minta

Az A260 értéke 0,5, nincs hígítás (hígítási tényező: 1), a mintatérfogat pedig 100 µL.

• Koncentráció = 0,5 × 50 × 1 = 25 ng/µL
• Teljes DNS-mennyiség = 25 × 100 ÷ 1000 = 2,5 µg

2. példa: hígított minta

Egy cső 50 µL tisztított DNS-t tartalmaz. Egy kis részét 10-szeresére hígították, és a hígított rész A260 értéke 0,75 lett. A hígítási tényező ezt az értéket az eredeti csőben lévő koncentrációra számítja vissza, a teljes hozam kiszámításához pedig a beírandó térfogat 50 µL.

• Koncentráció = 0,75 × 50 × 10 = 375 ng/µL
• Teljes DNS-mennyiség = 375 × 50 ÷ 1000 = 18,75 µg

A hígítási tényező kiszámítása

Hígítási tényező = hígítás utáni teljes térfogat ÷ az eredeti minta térfogata.

5 µL DNS-oldat 45 µL pufferhez adva a teljes térfogat 50 µL lesz, ezért a hígítási tényező 50 ÷ 5 = 10. A nem hígított minta hígítási tényezője 1.

A DNS-koncentráció jellemző tartományai

A koncentráció a minta típusától és az extrakciós módszertől függ. A genomiális DNS kivonásakor az érték általában körülbelül 10 és 100 ng/µL között van. A plazmid-DNS-készítmények gyakran magasabb koncentrációt adnak, néha több száz ng/µL-t. Ha egy módszernél az eredmény messze kívül esik a várt tartományon, az extrakcióval vagy magával a méréssel kapcsolatos problémára utalhat.

Az UV-abszorbancia mérésének korlátai

Az A260 mérése gyors, de a DNS vizsgálatára nem ez a legérzékenyebb vagy legspecifikusabb módszer. A fehérjék, az RNS és egyes pufferkomponensek szintén elnyelik a fényt a 260 nm körüli tartományban, és megnövelhetik a mért értéket. A fehérjeszennyeződés kiszűrésére a kutatók gyakran a koncentráció mellett az A260/A280 arányt is ellenőrzik; az 1,8 körüli arány általában tiszta DNS-mintát jelez. A fluoreszcens festékalapú módszerek, például a Qubit-vizsgálatok, csak a kétszálú DNS-hez kötődnek, és híg vagy szennyezett minták esetén pontosabb mérést adnak, de további reagenseket és fluorométert igényelnek.

Gyakran ismételt kérdések

Hogyan számítható ki a DNS-koncentráció az A260 értékből?

Szorozza meg az A260 értékét 50-nel, amely a kétszálú DNS szabványos átváltási tényezője, majd szorozza meg a hígítási tényezővel. Ha a mintát nem hígították, használjon 1 hígítási tényezőt.

Milyen a megfelelő A260/A280 arány?

A 1,8 körüli arány általában tiszta DNS-mintát jelez. Az alacsonyabb arány fehérjeszennyeződésre utal. A 2,0 feletti arány RNS-szennyeződést jelezhet.

Használható ez a kalkulátor RNS-hez?

Közvetlenül nem, mert az RNS esetében 40 ng/µL átváltási tényezőt kell használni 50 helyett. Az RNS-koncentráció becsléséhez szorozza meg a kalkulátor eredményét a 0,8 értékével (40 ÷ 50), vagy közvetlenül használja az A260 × 40 × hígítási tényező képletet.

Miért kell az A260 értékének 0,1 és 1,0 között lennie?

Az abszorbancia főként ebben a tartományban marad nagyjából arányos a koncentrációval, a Beer–Lambert-törvénynek megfelelően. Ezen kívül a mérések kevésbé megbízhatóvá válnak, ezért a túl koncentrált vagy túl híg mintát újramérés előtt hígítani vagy koncentrálni kell.

Mi a különbség a koncentráció és a tisztaság között?

A koncentráció azt méri, hogy mennyi DNS van jelen, ng/µL-ben kifejezve. A tisztaság azt mutatja, mennyire tiszta a minta; ezt főként az olyan abszorbanciaarányok alapján ítélik meg, mint az A260/A280. Egy minta koncentrációja lehet magas úgy is, hogy közben szennyezett, illetve lehet alacsony és nagyon tiszta.

Hogyan váltható át az ng/µL µg/mL-re?

A két mértékegység számértéke azonos. 1 ng/µL = 1 µg/mL, mert a tömeg- és a térfogategység is 1000-es tényezővel változik.

Hivatkozások

1. Sambrook, J. és Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3. kiadás). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
2. Gallagher, S. R. és Desjardins, P. R. (2006). A DNS és az RNS mennyiségi meghatározása abszorpciós és fluoreszcenciaspektroszkópiával. Current Protocols in Molecular Biology, 76(1), A-3D.
3. Manchester, K. L. (1995). Az A260/A280 arányok értéke a nukleinsavak tisztaságának mérésében. BioTechniques, 19(2), 208–210.