DNS Ligation Kalkulátor

Bevezetés

A DNS ligáció egy kritikus molekuláris biológiai technika, amelyet DNS fragmentumok összekapcsolására használnak kovalens kötések révén. A DNS Ligation Kalkulátor egy alapvető eszköz a kutatók számára, amely segít meghatározni a sikeres ligációs reakciókhoz szükséges optimális vektor- és insert DNS mennyiségeket. Azáltal, hogy kiszámítja a vektor (plazmid) és az insert DNS fragmentumok közötti megfelelő moláris arányokat, ez a kalkulátor biztosítja a hatékony molekuláris klónozási kísérleteket, miközben minimalizálja a pazarolt reagenseket és a sikertelen reakciókat.

A ligációs reakciók alapvetőek a géntechnológiában, a szintetikus biológiában és a molekuláris klónozási eljárásokban. Lehetővé teszik a tudósok számára, hogy rekombináns DNS molekulákat hozzanak létre az érdeklődő gének plazmid vektorokba történő beillesztésével a későbbi host organizmusokba történő transzformálás céljából. E reakciók sikeressége nagymértékben függ a DNS összetevők megfelelő mennyiségének használatától, amelyet ez a kalkulátor segít meghatározni.

Akár expressziós vektorokat épít, akár génkönyvtárakat hoz létre, vagy rutinszerű alklónozást végez, ez a DNS ligációs kalkulátor segít optimalizálni kísérleti feltételeit és növelni a sikerességi arányát. Néhány kulcsparaméter megadásával a DNS mintáiról gyorsan megkaphatja a szükséges pontos térfogatokat a specifikus ligációs reakciójához.

Formula/Kalkuláció

A DNS ligációs kalkulátor egy alapvető molekuláris biológiai formulát használ, amely figyelembe veszi a csatlakozó DNS fragmentumok különböző méreteit és koncentrációit. A fő számítás meghatározza, hogy mennyi insert DNS szükséges a vektor DNS-hez képest, a hosszuk és a kívánt moláris arány alapján.

Insert Mennyiség Kiszámítása

A szükséges insert DNS mennyiséget (nanogrammban) a következő formula segítségével számítjuk ki:

$\text{ng of insert} = \text{ng of vector} \times \frac{\text{kb size of insert}}{\text{kb size of vector}} \times \text{molar ratio}$

Ahol:

ng of vector = a reakcióban használt vektor DNS mennyisége (tipikusan 50-100 ng)
kb size of insert = az insert DNS fragmentum hossza kilobázisokban (kb)
kb size of vector = a vektor DNS hossza kilobázisokban (kb)
molar ratio = a kívánt arány az insert és a vektor molekulái között (tipikusan 3:1 és 5:1 között)

Térfogat Kalkulációk

Miután meghatároztuk a szükséges insert DNS mennyiséget, kiszámítjuk a reakcióhoz szükséges térfogatokat:

$\text{Vector volume (μL)} = \frac{\text{ng of vector}}{\text{vector concentration (ng/μL)}}$

$\text{Insert volume (μL)} = \frac{\text{ng of insert}}{\text{insert concentration (ng/μL)}}$

$\text{Buffer/water volume (μL)} = \text{Total reaction volume (μL)} - \text{Vector volume (μL)} - \text{Insert volume (μL)}$

Példa Kiszámítása

Nézzük meg egy gyakorlati példát:

Vektor koncentráció: 50 ng/μL
Vektor hossz: 3000 bp (3 kb)
Insert koncentráció: 25 ng/μL
Insert hossz: 1000 bp (1 kb)
Kívánt moláris arány (insert:vectort): 3:1
Teljes reakció térfogat: 20 μL
Használni kívánt vektor mennyiség: 50 ng

lépés: Számítsuk ki a szükséges insert mennyiséget $\text{ng of insert} = 50 \text{ ng} \times \frac{1 \text{ kb}}{3 \text{ kb}} \times 3 = 50 \times 0.33 \times 3 = 50 \text{ ng}$
lépés: Számítsuk ki a térfogatokat $\text{Vector volume} = \frac{50 \text{ ng}}{50 \text{ ng/μL}} = 1 \text{ μL}$

$\text{Insert volume} = \frac{50 \text{ ng}}{25 \text{ ng/μL}} = 2 \text{ μL}$

$\text{Buffer/water volume} = 20 \text{ μL} - 1 \text{ μL} - 2 \text{ μL} = 17 \text{ μL}$

Ez a számítás biztosítja, hogy a reakcióban három insert molekula legyen minden egyes vektor molekulához, optimalizálva a sikeres ligáció esélyeit.

Lépésről Lépésre Útmutató a Kalkulátor Használatához

A DNS Ligation Kalkulátorunk intuitív és egyszerű használatra van tervezve. Kövesse az alábbi lépéseket a ligációs reakcióhoz szükséges optimális térfogatok kiszámításához:

Adja meg a Vektor Információkat:
- Írja be a vektor koncentrációját ng/μL-ben
- Adja meg a vektor hosszát bázispárokban (bp)
- Adja meg a reakcióban használni kívánt vektor DNS mennyiségét (ng)
Adja meg az Insert Információkat:
- Írja be az insert koncentrációját ng/μL-ben
- Adja meg az insert hosszát bázispárokban (bp)
Állítsa be a Reakció Paramétereit:
- Adja meg a kívánt moláris arányt (insert:vektor) - tipikusan 3:1 és 5:1 között
- Adja meg a teljes reakció térfogatot μL-ben (általában 10-20 μL)
Nézze meg az Eredményeket:
- A kalkulátor automatikusan megjeleníti:
  - Szükséges vektor térfogat (μL)
  - Szükséges insert térfogat (μL)
  - Hozzáadandó puffer/víz térfogat (μL)
  - Teljes reakció térfogat (μL)
  - A reakcióban lévő vektor és insert DNS mennyisége (ng)
Eredmények Másolása (opcionális):
- Használja a "Másolás Eredmények" gombot, hogy az összes számítást a vágólapra másolja a laborjegyzetéhez vagy protokolljaihoz

A kalkulátor validálási ellenőrzéseket végez, hogy biztosítsa, hogy minden bemenet pozitív szám, és hogy a teljes térfogat elegendő a szükséges DNS térfogatokhoz. Ha bármilyen hibát észlel, hasznos hibaüzenetek segítenek a bemenetek javításában.

Használati Esetek

A DNS Ligation Kalkulátor számos molekuláris biológiai alkalmazásban értékes:

Molekuláris Klónozás

A leggyakoribb felhasználási eset a standard molekuláris klónozás, ahol a kutatók géneket vagy DNS fragmentumokat illesztenek be plazmid vektorokba. A kalkulátor biztosítja az optimális feltételeket:

Gének alklónozása különböző expressziós vektorok között
Fúziós fehérjék létrehozása több gén fragmentum összekapcsolásával
Jelző gén vizsgálatok építése
Plazmid könyvtárak létrehozása

Szintetikus Biológia

A szintetikus biológiában, ahol gyakran több DNS fragmentumot kell összeszerelni:

A Gibson Assembly reakciók profitálnak a pontos insert:vektor arányokból
A Golden Gate összeszerelési rendszerek speciális DNS koncentrációkat igényelnek
BioBrick összeszerelés szabványosított genetikai részekből
Szintetikus genetikai áramkörök építése

Diagnosztikai Készlet Fejlesztése

Molekuláris diagnosztikai eszközök fejlesztésekor:

Betegség-specifikus genetikai markerek klónozása
Pozitív kontroll plazmidok létrehozása
Kalibráló standardok fejlesztése qPCR-hez

Fehérje Expressziós Rendszerek

A fehérje termelésen dolgozó kutatók számára:

Insert:vektor arányok optimalizálása nagy másolatú expressziós vektorok esetén
Indukálható expressziós rendszerek létrehozása
Szekréciós vektorok létrehozása fehérje tisztításához

CRISPR-Cas9 Alkalmazások

A genomszerkesztési alkalmazásokban:

Útmutató RNS-ek klónozása CRISPR vektorokba
Donor sablonok létrehozása homológiás irányított javításhoz
Útmutató RNS könyvtárak építése szűréshez

Kihívást Jelentő Ligációk

A kalkulátor különösen értékes a kihívást jelentő ligációs forgatókönyvekben:

Nagy insert klónozás (>5 kb)
Nagyon kis fragmentumok beillesztése (<100 bp)
Blunt-end ligációk, amelyek alacsonyabb hatékonysággal bírnak
Több fragmentum összeszerelési reakciók

Alternatívák

Bár a DNS Ligation Kalkulátor pontos számításokat biztosít a hagyományos ligációs reakciókhoz, több alternatív megközelítés is létezik a DNS fragmentumok összekapcsolására:

Gibson Assembly: Exonukleáz, polimeráz és ligáz egy lépéses reakcióban történő felhasználásával összekapcsolja a fedett DNS fragmentumokat. Nincs szükség hagyományos ligációs számításra, de a koncentrációs arányok továbbra is fontosak.
Golden Gate Assembly: Irányított, hegy nélküli összeszerelés a Type IIS restrikciós enzimek segítségével. Az összes fragmentum egyenlő moláris mennyiségeit igényli.
SLIC (Sequence and Ligation Independent Cloning): Exonukleáz használatával egyláncú kiemelkedéseket hoz létre, amelyek összekapcsolódnak. Általában az összes fragmentum egyenlő moláris arányait használja.
In-Fusion Cloning: Kereskedelmi rendszer, amely lehetővé teszi a fragmentumok 15 bp-os átfedésekkel történő összekapcsolását. A fragmentumok mérete alapján meghatározott arányt használ.
Gateway Cloning: Hely-specifikus rekombinációt használ a ligáció helyett. Speciális belépési és célvektorokat igényel.
Empirikus Tesztelés: Néhány laboratórium inkább több ligációs reakciót állít be különböző insert:vektor arányokkal (1:1, 3:1, 5:1, 10:1), és meghatározza, melyik működik a legjobban a specifikus konstrukcióikhoz.
Szoftver Kalkulátorok: Kereskedelmi szoftvercsomagok, mint a Vector NTI és SnapGene, ligációs kalkulátorokat tartalmaznak további funkciókkal, mint például restrikciós helyek elemzése.

Történelem

A DNS ligációs számítások fejlődése párhuzamosan haladt a molekuláris klónozási technikák fejlődésével, amelyek forradalmasították a molekuláris biológiát és a biotechnológiát.

Korai Fejlesztések (1970-es Évek)

A DNS ligáció fogalma a molekuláris klónozás számára az 1970-es évek elején merült fel Paul Berg, Herbert Boyer és Stanley Cohen úttörő munkájával, akik az első rekombináns DNS molekulákat fejlesztették ki. Ekkoriban a ligációs reakciók nagyrészt empirikusak voltak, a kutatók próbálkozás és hiba útján határozták meg az optimális feltételeket.

A restrikciós enzimek és a DNS ligáz felfedezése biztosította az alapvető eszközöket a DNS molekulák vágásához és újraegyesítéséhez. A T4 DNS ligáz, amelyet a T4 bakteriofág által fertőzött E. coli-ból izoláltak, a DNS fragmentumok összekapcsolásának standard enzime lett, mivel képes összekapcsolni a blunt és a koherens végeket is.

Finomítási Időszak (1980-as-1990-es Évek)

Ahogy a molekuláris klónozás rutinszerűvé vált, a kutatók egyre inkább rendszerszerű megközelítéseket kezdtek kidolgozni a ligációs reakciókhoz. Nyilvánvalóvá vált a vektor és az insert DNS közötti moláris arányok fontossága, ami a mai napig használt alapformula kidolgozásához vezetett.

Ez idő alatt a kutatók megállapították, hogy a felesleges insert DNS (tipikusan 3:1 és 5:1 moláris arány az alapértelmezett klónozási alkalmazásokhoz) általában javítja a ligációs hatékonyságot. E tudást kezdetben laboratóriumi protokollokon osztották meg, és fokozatosan beépült a molekuláris biológiai kézikönyvekbe és tankönyvekbe.

Modern Kor (2000-es Évek-Jelen)

A számítógépes eszközök és online kalkulátorok megjelenése a 2000-es években lehetővé tette a pontos ligációs számítások elérhetőségét a kutatók számára. Ahogy a molekuláris biológiai technikák egyre kifinomultabbá váltak, a pontos számítások iránti igény is nőtt, különösen a több fragmentumot vagy nagy insertumokat érintő kihívást jelentő klónozási projektek esetében.

Ma a DNS ligációs számítások a molekuláris klónozási munkafolyamatok szerves részét képezik, olyan dedikált kalkulátorok, mint ez, segítik a kutatókat a kísérleteik optimalizálásában. Az alapformula nagyrészt változatlan maradt, bár a ligációs hatékonyságot befolyásoló tényezők megértése javult.

A Gibson Assembly és a Golden Gate klónozás alternatív módszereinek megjelenése új számítási igényeket vezetett be, de a DNS fragmentumok közötti moláris arányok alapvető fogalma továbbra is fontos marad e technikákban.

Kód Példák

Itt vannak a DNS ligációs kalkulátor megvalósításai különböző programozási nyelvekben:

1' Excel VBA Funkció a DNS Ligation Kalkulátorhoz
2Function CalculateInsertAmount(vectorAmount As Double, vectorLength As Double, insertLength As Double, molarRatio As Double) As Double
3    ' Számítsa ki a szükséges insert mennyiséget ng-ban
4    CalculateInsertAmount = vectorAmount * (insertLength / vectorLength) * molarRatio
5End Function
6
7Function CalculateVectorVolume(vectorAmount As Double, vectorConcentration As Double) As Double
8    ' Számítsa ki a vektor térfogatát μL-ben
9    CalculateVectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration
10End Function
11
12Function CalculateInsertVolume(insertAmount As Double, insertConcentration As Double) As Double
13    ' Számítsa ki az insert térfogatát μL-ben
14    CalculateInsertVolume = insertAmount / insertConcentration
15End Function
16
17Function CalculateBufferVolume(totalVolume As Double, vectorVolume As Double, insertVolume As Double) As Double
18    ' Számítsa ki a puffer/víz térfogatát μL-ben
19    CalculateBufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume
20End Function
21
22' Használati példa egy cellában:
23' =CalculateInsertAmount(50, 3000, 1000, 3)
24

1def calculate_ligation_volumes(vector_concentration, vector_length, insert_concentration, 
2                              insert_length, molar_ratio, total_volume, vector_amount=50):
3    """
4    Számítsa ki a térfogatokat egy DNS ligációs reakcióhoz.
5    
6    Paraméterek:
7    vector_concentration (float): Vektor DNS koncentráció ng/μL-ben
8    vector_length (float): Vektor DNS hossza bázispárokban
9    insert_concentration (float): Insert DNS koncentráció ng/μL-ben
10    insert_length (float): Insert DNS hossza bázispárokban
11    molar_ratio (float): Kívánt moláris arány insert:vektor
12    total_volume (float): Teljes reakció térfogat μL-ben
13    vector_amount (float): Használni kívánt vektor DNS mennyisége ng-ban (alapértelmezett: 50)
14    
15    Visszatér:
16    dict: Szótár, amely tartalmazza a kiszámított térfogatokat és mennyiségeket
17    """
18    # Számítsa ki a vektor térfogatát
19    vector_volume = vector_amount / vector_concentration
20    
21    # Számítsa ki a szükséges insert mennyiséget
22    vector_length_kb = vector_length / 1000
23    insert_length_kb = insert_length / 1000
24    insert_amount = (vector_amount * insert_length_kb / vector_length_kb) * molar_ratio
25    
26    # Számítsa ki az insert térfogatát
27    insert_volume = insert_amount / insert_concentration
28    
29    # Számítsa ki a puffer/víz térfogatát
30    buffer_volume = total_volume - vector_volume - insert_volume
31    
32    return {
33        "vector_volume": round(vector_volume, 2),
34        "insert_volume": round(insert_volume, 2),
35        "buffer_volume": round(buffer_volume, 2),
36        "insert_amount": round(insert_amount, 2),
37        "vector_amount": vector_amount
38    }
39
40# Példa használat
41result = calculate_ligation_volumes(
42    vector_concentration=50,
43    vector_length=3000,
44    insert_concentration=25,
45    insert_length=1000,
46    molar_ratio=3,
47    total_volume=20
48)
49
50print(f"Vektor: {result['vector_volume']} μL ({result['vector_amount']} ng)")
51print(f"Insert: {result['insert_volume']} μL ({result['insert_amount']} ng)")
52print(f"Puffer: {result['buffer_volume']} μL")
53print(f"Összesen: 20 μL")
54

1function calculateLigationVolumes(vectorConcentration, vectorLength, insertConcentration, 
2                                insertLength, molarRatio, totalVolume, vectorAmount = 50) {
3  // A hosszakat kb-ra konvertáljuk a számításhoz
4  const vectorLengthKb = vectorLength / 1000;
5  const insertLengthKb = insertLength / 1000;
6  
7  // Számítsa ki a szükséges insert mennyiséget
8  const insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
9  
10  // Számítsa ki a térfogatokat
11  const vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
12  const insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
13  const bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
14  
15  return {
16    vectorVolume: parseFloat(vectorVolume.toFixed(2)),
17    insertVolume: parseFloat(insertVolume.toFixed(2)),
18    bufferVolume: parseFloat(bufferVolume.toFixed(2)),
19    insertAmount: parseFloat(insertAmount.toFixed(2)),
20    vectorAmount: vectorAmount
21  };
22}
23
24// Példa használat
25const result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
26console.log(`Vektor: ${result.vectorVolume} μL (${result.vectorAmount} ng)`);
27console.log(`Insert: ${result.insertVolume} μL (${result.insertAmount} ng)`);
28console.log(`Puffer: ${result.bufferVolume} μL`);
29console.log(`Összesen: 20 μL`);
30

1public class DNALigationCalculator {
2    public static class LigationResult {
3        public final double vectorVolume;
4        public final double insertVolume;
5        public final double bufferVolume;
6        public final double insertAmount;
7        public final double vectorAmount;
8        
9        public LigationResult(double vectorVolume, double insertVolume, double bufferVolume, 
10                             double insertAmount, double vectorAmount) {
11            this.vectorVolume = vectorVolume;
12            this.insertVolume = insertVolume;
13            this.bufferVolume = bufferVolume;
14            this.insertAmount = insertAmount;
15            this.vectorAmount = vectorAmount;
16        }
17    }
18    
19    public static LigationResult calculateLigationVolumes(
20            double vectorConcentration, double vectorLength, 
21            double insertConcentration, double insertLength,
22            double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount) {
23        
24        // A hosszakat kb-ra konvertáljuk
25        double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
26        double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
27        
28        // Számítsa ki a szükséges insert mennyiséget
29        double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
30        
31        // Számítsa ki a térfogatokat
32        double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
33        double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
34        double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
35        
36        // Kerekítse 2 tizedesjegyre
37        vectorVolume = Math.round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
38        insertVolume = Math.round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
39        bufferVolume = Math.round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
40        insertAmount = Math.round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
41        
42        return new LigationResult(vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount);
43    }
44    
45    public static void main(String[] args) {
46        LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20, 50);
47        
48        System.out.printf("Vektor: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.vectorVolume, result.vectorAmount);
49        System.out.printf("Insert: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.insertVolume, result.insertAmount);
50        System.out.printf("Puffer: %.2f μL%n", result.bufferVolume);
51        System.out.printf("Összesen: 20 μL%n");
52    }
53}
54

1#include <iostream>
2#include <cmath>
3#include <iomanip>
4
5struct LigationResult {
6    double vectorVolume;
7    double insertVolume;
8    double bufferVolume;
9    double insertAmount;
10    double vectorAmount;
11};
12
13LigationResult calculateLigationVolumes(
14    double vectorConcentration, double vectorLength,
15    double insertConcentration, double insertLength,
16    double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount = 50.0) {
17    
18    // A hosszakat kb-ra konvertáljuk
19    double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
20    double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
21    
22    // Számítsa ki a szükséges insert mennyiséget
23    double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
24    
25    // Számítsa ki a térfogatokat
26    double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
27    double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
28    double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
29    
30    // Kerekítse 2 tizedesjegyre
31    vectorVolume = std::round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
32    insertVolume = std::round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
33    bufferVolume = std::round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
34    insertAmount = std::round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
35    
36    return {vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount};
37}
38
39int main() {
40    LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
41    
42    std::cout << std::fixed << std::setprecision(2);
43    std::cout << "Vektor: " << result.vectorVolume << " μL (" << result.vectorAmount << " ng)" << std::endl;
44    std::cout << "Insert: " << result.insertVolume << " μL (" << result.insertAmount << " ng)" << std::endl;
45    std::cout << "Puffer: " << result.bufferVolume << " μL" << std::endl;
46    std::cout << "Összesen: 20 μL" << std::endl;
47    
48    return 0;
49}
50

GYIK (Gyakran Ismételt Kérdések)

Mi az optimális moláris arány a DNS ligációhoz?

A legoptimálisabb insert-vektor moláris arány tipikusan 3:1 és 5:1 között van a standard klónozási alkalmazásokhoz. Azonban ez változhat a specifikus ligációs forgatókönyv függvényében:

Blunt-end ligációk esetén: 3:1-től 5:1-ig
Sticky-end ligációk esetén: 1:1-től 3:1-ig
Nagy insertumok (>10 kb) esetén: 1:1-től 2:1-ig
Kicsi insertumok (<500 bp) esetén: 5:1-től 10:1-ig
Több fragmentum összeszerelésénél: 3:1 minden insert és vektor között

Miért nem működik a ligációs reakcióm, annak ellenére, hogy a számított térfogatokkal dolgozom?

Számos tényező befolyásolhatja a ligáció hatékonyságát a moláris arányokon túl:

DNS minőség: Győződjön meg róla, hogy mind a vektor, mind az insert tiszta végekkel rendelkezik, és nem sérült
Dephosphoryláció: Ellenőrizze, hogy a vektorja dephosphorylálva lett-e, ami megakadályozza az önligációt
Enzim aktivitás: Ellenőrizze, hogy a ligáz aktív-e és a megfelelő hőmérsékleten használja
Inkubációs idő: Néhány ligáció a hosszabb inkubációt (több órát vagy akár éjszakát 16°C-on) kedveli
Pufferek feltételei: Győződjön meg róla, hogy a megfelelő puffert ATP-vel használja
Szennyeződések: Tisztítsa meg a DNS-t, hogy eltávolítsa az inhibitorokat, mint az EDTA vagy a magas sótartalom

Mennyi vektor DNS-t kell használnom egy ligációs reakcióban?

Általában 50-100 ng vektor DNS-t ajánlott használni standard ligációs reakciókhoz. Túl sok vektor használata a vágatlan vagy önligált vektor magasabb háttérsűrűségét okozhatja, míg túl kevés csökkentheti a transzformációs hatékonyságot. Kihívást jelentő ligációk esetén érdemes optimalizálni ezt a mennyiséget.

Ki kell-e igazítanom a számításokat a blunt-end és sticky-end ligációk között?

Igen. A blunt-end ligációk általában kevésbé hatékonyak, mint a sticky-end (koherens végű) ligációk. Blunt-end ligációk esetén:

Magasabb moláris arányokat használjon (3:1-től 5:1-ig vagy még magasabb)
T4 DNS ligázból (tipikusan 2-3-szor többet)
Hosszabb inkubációs időt
Fontolja meg, hogy PEG-t adjon hozzá a ligációs hatékonyság növelésére

Hogyan számolom ki a ligációt több insert esetén?

Több fragmentum összeszerelésénél:

Számolja ki minden insert mennyiségét külön-külön a fenti formula alapján
Tartsa meg a teljes moláris arányt (pl. két insert esetén 1.5:1.5:1 insert1:insert2:vector)
Állítsa be a teljes reakció térfogatot, hogy figyelembe vegye az összes DNS fragmentumot
Fontolja meg a szekvenciális ligációt vagy a Gibson Assembly módszerek használatát több fragmentum esetén

Használhatom ezt a kalkulátort Gibson Assembly vagy Golden Gate Assembly esetén?

Ez a kalkulátor kifejezetten a hagyományos restrikciós enzim és ligáz alapú klónozásra van tervezve. A Gibson Assembly esetén az összes fragmentum egyenlő moláris mennyiségeit javasolják (1:1 arány), bár a DNS mennyiség hossz alapján történő számítása hasonló. A Golden Gate Assembly esetén is általában az összes komponens egyenlő moláris arányait használják.

Hogyan vegyem figyelembe a vektor dephosphorylációját a számításaimban?

A vektor dephosphorylációja (az 5' foszfátcsoportok eltávolítása) megakadályozza az önligációt, de nem változtatja meg a mennyiségi számításokat. Azonban dephosphorylált vektorok esetén:

Használjon friss insert DNS-t, amelynek ép 5' foszfátjai vannak
Fontolja meg, hogy kissé magasabb insert:vektor arányokat használjon (4:1-től 6:1-ig)
Hosszabb ligációs időt (legalább 1 óra szobahőmérsékleten vagy éjszaka 16°C-on)

Mi a minimális teljes reakció térfogat, amit használhatok?

A minimális gyakorlati reakció térfogat jellemzően 10 μL, ami elegendő keverést biztosít, és megakadályozza az elpárolgási problémákat. Ha a számított DNS térfogatok meghaladják a kívánt reakció térfogatot, több lehetősége van:

Használjon koncentráltabb DNS mintákat
Csökkentse a használandó vektor mennyiségét (pl. 25 ng a 50 ng helyett)
Növelje a teljes reakció térfogatot
Fontolja meg a DNS minták koncentrálását

Mennyi ideig inkubáljam a ligációs reakciómat?

Az optimális inkubációs idő a ligáció típusától függ:

Sticky-end ligációk: 1 óra szobahőmérsékleten (22-25°C) vagy 4-16 óra 16°C-on
Blunt-end ligációk: 2-4 óra szobahőmérsékleten vagy éjszaka (12-16 óra) 16°C-on
Gyors ligációk (magas koncentrációjú ligáz használatával): 5-15 perc szobahőmérsékleten

Újra felhasználhatom a megmaradt ligációs reakciót transzformációhoz?

Igen, a ligációs keverékek általában tárolhatók -20°C-on, és újra felhasználhatók transzformációhoz. Azonban minden egyes fagyasztás-olvasztás ciklus csökkentheti a hatékonyságot. A legjobb eredmények érdekében:

Alikvotálja a ligációs keveréket a fagyasztás előtt
Hőkezelje a ligázt (65°C-on 10 percig) a tárolás előtt
Használja fel 1-2 hónapon belül a legjobb eredményekért

Hivatkozások

Sambrook J, Russell DW. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Green MR, Sambrook J. (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Engler C, Kandzia R, Marillonnet S. (2008). A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS ONE, 3(11), e3647. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003647
Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. (2009). Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods, 6(5), 343-345. https://doi.org/10.1038/nmeth.1318
Aslanidis C, de Jong PJ. (1990). Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research, 18(20), 6069-6074. https://doi.org/10.1093/nar/18.20.6069
Zimmerman SB, Pheiffer BH. (1983). Macromolecular crowding allows blunt-end ligation by DNA ligases from rat liver or Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences, 80(19), 5852-5856. https://doi.org/10.1073/pnas.80.19.5852
Addgene - Molecular Biology Reference. https://www.addgene.org/mol-bio-reference/
New England Biolabs (NEB) - DNA Ligation Protocol. https://www.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202
Thermo Fisher Scientific - Molecular Cloning Technical Reference. https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center.html
Promega - Cloning Technical Manual. https://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/cloning/

DNS Ligációs Kalkulátor Molekuláris Klónozási Kísérletekhez

DNS Ligációs Számológép

Bemeneti Paraméterek

Ligációs Eredmények

Dokumentáció