DNS Ligáció Kalkulátor - Inzert:Vektor Arányok Számítása Molekuláris Klónozáshoz

A DNS-ligálás a molekuláris klónozásnak az a lépése, amelyben egy inzertfragmentumot T4 DNS-ligáz enzim segítségével plazmidvektorhoz kapcsolnak. A DNS-ligálási kalkulátor kiszámítja, hány mikroliter inzert-DNS-t és vektor-DNS-t kell összekeverni ahhoz, hogy a reakció elérje az inzert és a vektor kiválasztott moláris arányát.

Mire képes a kalkulátor

A kalkulátor hat bemeneti adatot használ: a vektor koncentrációját, a vektor hosszát, az inzert koncentrációját, az inzert hosszát, az inzert és a vektor célzott moláris arányát, valamint a reakció teljes térfogatát. Azt is lehetővé teszi, hogy a felhasználó beállítsa a felhasználandó vektor-DNS mennyiségét, amelynek alapértelmezett értéke 50 nanogramm (ng). Ezekből az értékekből kiszámítja a pipettázandó vektor térfogatát, a pipettázandó inzert térfogatát, valamint a teljes reakciótérfogat eléréséhez hozzáadandó puffer vagy víz mennyiségét.

A koncentrációt nanogramm/mikroliterben (ng/μL) mérik, rendszerint Nanodrop- vagy Qubit-műszerrel. A hosszt bázispárban (bp) adják meg. Egy kilobázis (kb) 1000 bázispárnak felel meg. A moláris arány azt fejezi ki, hogy minden egyes vektormolekulára hány inzertmolekulának kell jutnia. Ez nem tömegarány.

Miért moláris arányt és nem tömeget használunk?

Azonos DNS-tömegek nem tartalmaznak azonos számú molekulát. Egy rövid inzert kevesebbet nyom, mint egy hosszú vektor ugyanannyi molekula esetén. Ha egy rövid inzertből és egy hosszú vektorból azonos nanogramm-mennyiségeket kevernénk össze, az inzertmolekulák száma a vektormolekulák számához képest túl kicsi lenne. A kalkulátor az inzert tömegét a fragmentumhosszak arányával skálázza, így a végső elegyben vektormolekulánként a kívánt számú inzertmolekula lesz.

A DNS-ligálás képlete

A szükséges inzert-DNS mennyisége nanogrammban:

$m_i = m_v \times \frac{k_i}{k_v} \times R$

ahol $m_i$ az inzert mennyisége nanogrammban, $m_v$ a vektor mennyisége nanogrammban, $k_i$ az inzert hossza kilobázisban, $k_v$ a vektor hossza kilobázisban, R pedig az inzert és a vektor célzott moláris aránya.

Ennek a mennyiségnek az ismeretében a kalkulátor mindkét mennyiséget pipettázható térfogattá alakítja:

$V_v = \frac{m_v}{c_v}$

$V_i = \frac{m_i}{c_i}$

$V_b = V_t - V_v - V_i$

ahol $V_v$ és $V_i$ a vektor, illetve az inzert térfogata mikroliterben, $c_v$ és $c_i$ a vektor, illetve az inzert koncentrációja nanogramm/mikroliterben, $V_b$ a puffer térfogata, $V_t$ pedig a reakció teljes térfogata.

Ha a vektor és az inzert együttes térfogata nagyobb a reakció teljes térfogatánál, nem marad hely puffer, ligáz vagy víz számára. Ilyenkor a kalkulátor a teljes térfogatot túl kicsinek jelzi, ahelyett hogy negatív pufferértéket jelenítene meg.

Megoldott példa

Egy kutató egy 1 kb hosszúságú génfragmentumot klónoz egy 3 kb hosszúságú plazmidvektorba. A terv szerint 50 ng vektor-DNS-t használnak, 3:1 inzert:vektor moláris arány mellett, egy 20 μL térfogatú reakcióban.

Bemeneti adatok:

• Vektor koncentrációja: 50 ng/μL
• Vektor hossza: 3000 bp (3 kb)
• Inzert koncentrációja: 25 ng/μL
• Inzert hossza: 1000 bp (1 kb)
• Moláris arány: 3
• Teljes térfogat: 20 μL
• Vektor mennyisége: 50 ng

1. lépés: az inzert mennyisége

inzert ng-ban = 50 × (1 ÷ 3) × 3 = 50 ng

2. lépés: a térfogatok

Vektor térfogata = 50 ng ÷ 50 ng/μL = 1 μL

Inzert térfogata = 50 ng ÷ 25 ng/μL = 2 μL

Puffer térfogata = 20 − 1 − 2 = 17 μL

A reakció 1 μL vektorból, 2 μL inzertből és 17 μL pufferből vagy vízből áll; ide adják hozzá a ligázt és annak reakciópufferét is. Ez az elegy minden egyes vektormolekulára három inzertmolekulát biztosít.

Tipikus moláris arányok ligálásnál

A tapadós, túlnyúló végeket használó szokásos klónozásban többnyire 3:1 inzert:vektor arányt alkalmaznak. A tompa végek összekapcsolása kevésbé hatékony, ezért gyakori a magasabb, például 5:1 arány. A nagyon nagy inzertek esetében néha alacsonyabb, 1:1-hez közeli arány működik jobban, mivel a nagy fragmentumok molekulánként eleve sok bázispárt tartalmaznak.

Gyakran ismételt kérdések

Mi a DNS-ligálás?

A DNS-ligálás két DNS-fragmentum — jellemzően egy plazmidvektor és egy inzert — egyetlen folytonos molekulává kapcsolása. A T4 DNS-ligáz enzim lezárja a fragmentumok végei közötti kapcsolatot.

Mit jelent az inzert:vektor mólaránya?

A reakcióban minden egyes vektormolekulára jutó inzert-DNS-molekulák számát jelenti. Az 3:1 arány azt jelenti, hogy minden egyes vektormolekulára három inzertmolekula jut, tömegük egymáshoz viszonyított arányától függetlenül.

Miért nem használunk azonos nanogramm-mennyiséget a vektorból és az inzertből?

Az eltérő hosszúságú DNS-fragmentumok molekulánként eltérő tömegűek. Egy 1 kb hosszúságú inzert molekulánként körülbelül harmadannyit nyom, mint egy 3 kb hosszúságú vektor. Azonos nanogramm-mennyiségek használata nem eredményezné azonos számú molekulát, ezért a kalkulátor az inzert tömegét a célzott moláris arányhoz igazítja.

Mit jelent, ha a teljes térfogat túl kicsi?

Azt jelenti, hogy a vektor és az inzert térfogata önmagában már kitölti a teljes reakciótérfogatot, így nem marad hely puffer vagy ligáz számára. A megoldás a reakció teljes térfogatának növelése vagy koncentráltabb DNS-törzsoldatok használata.

Használható ez a kalkulátor Gibson-összeállításhoz vagy Golden Gate klónozáshoz?

Nem. Ezek az eljárások eltérő reakciókémiát alkalmaznak, és rendszerint az összes fragmentum ekvimoláris mennyiségét célozzák meg, nem pedig rögzített inzert:vektor arányt. Térfogatszámításaik eltérnek a szokásos T4-ligázos klónozás számításaitól.

Általában mennyi vektor-DNS-t használnak?

A 50 ng gyakori kiindulási mennyiség egy szokásos ligálási reakcióban. A laboratóriumok 25 és 100 ng közötti mennyiségeket is használnak, a DNS koncentrációjához és a reakció méretéhez igazítva.