Számítsa ki a pontos mintavolumokat a BCA vizsgálati absorbancia mérések és a kívánt fehérje tömeg alapján. Elengedhetetlen a fehérje konzisztens terheléséhez western blotokban és más laboratóriumi alkalmazásokban.
Ez az eszköz kiszámítja a szükséges mintamennyiséget a BCA elszívás eredményei és a minta tömege alapján. Adja meg az elszívás értékét és a minta tömegét minden mintához, hogy kiszámolja a megfelelő mintamennyiséget.
A mintamennyiséget a következő képlet segítségével számítjuk ki:
• tipAbsorbanceRange
• tipSampleMass
• tipSampleVolume
• tipStandardCurve
A BCA Absorbance Minta Térfogat Kalkulátor egy speciális eszköz, amelyet kutatók és laboratóriumi technikusok számára terveztek, hogy pontosan meghatározzák a megfelelő minta térfogatot a BCA (bicinchoninsav) teszt eredményei alapján. Ez a kalkulátor a BCA tesztből származó abszorbancia-értékeket és a kívánt minta tömeget figyelembe véve kiszámítja a szükséges térfogatot a következetes fehérje terheléshez olyan alkalmazásokban, mint a western blot, enzimatikus tesztek és más fehérjeanalitikai technikák.
A BCA teszt az egyik legszélesebb körben használt módszer a fehérje mennyiségének meghatározására biokémiai és molekuláris biológiai laboratóriumokban. A fehérje minták abszorbancia-értékeinek mérésével és egy standard görbéhez való összehasonlításával a fehérje koncentrációját nagy pontossággal meghatározhatja. Kalkulátorunk leegyszerűsíti ezt a folyamatot azáltal, hogy automatikusan átváltja az abszorbancia-értékeket a kísérleteihez szükséges pontos minta térfogatokká.
A Bicinchoninsav (BCA) teszt egy biokémiai teszt a fehérje teljes koncentrációjának meghatározására egy oldatban. A teszt elve a Cu²⁺-fehérje komplex kialakulásán alapul alkalikus körülmények között, amelyet a Cu²⁺ Cu¹⁺-ra való redukálása követ. A redukció mértéke arányos a jelen lévő fehérjével. A BCA lila színű komplexet képez a Cu¹⁺-al alkalikus környezetben, ami alapot ad a fehérjék által okozott réz redukciójának nyomon követésére.
A lila szín intenzitása arányosan növekszik a fehérje koncentrációval, amelyet spektrofotométerrel lehet mérni körülbelül 562 nm-en. Az abszorbancia-értékeket ezután egy standard görbéhez hasonlítják, hogy meghatározzák az ismeretlen minták fehérje koncentrációját.
A BCA abszorbancia eredményekből származó minta térfogat kiszámításának alapvető képlete:
Ahol:
A fehérje koncentrációt az abszorbancia-értékből a standard görbe egyenlete segítségével számítják:
Egy tipikus BCA teszt esetén a szokásos meredekség körülbelül 2.0, és a metszéspont gyakran közel van a nullához, bár ezek az értékek változhatnak az Ön specifikus tesztkörülményei és standard görbéje alapján.
Kalkulátorunk leegyszerűsíti a minta térfogatának meghatározását a BCA teszt eredményeiből. Kövesse ezeket a lépéseket a pontos számításokhoz:
Minta Információk Megadása:
Standard Görbe Típusának Kiválasztása:
Eredmények Megtekintése:
Eredmények Másolása vagy Exportálása:
Nézzünk meg egy gyakorlati példát:
Ez azt jelenti, hogy 13.33 μL mintát kell betöltenie, hogy 20 μg fehérjét kapjon.
A kalkulátor több fontos információt nyújt:
Fehérje Koncentráció: Ez az Ön abszorbancia-értéke alapján a kiválasztott standard görbe segítségével számítva. Ez a minta egységnyi térfogatában lévő fehérje mennyiségét képviseli (μg/μL).
Minta Térfogat: Ez a minta térfogata, amely tartalmazza a kívánt fehérje mennyiséget. Ezt az értéket fogja használni a kísérletei előkészítésekor.
Figyelmeztetések és Ajánlások: A kalkulátor figyelmeztetéseket adhat:
A kalkulátor egyik leggyakoribb alkalmazása a minták előkészítése western blottinghoz. A következetes fehérje terhelés kulcsfontosságú a megbízható western blot eredményekhez, és ez a kalkulátor biztosítja, hogy minden mintából ugyanannyi fehérjét töltsön be, még akkor is, ha a koncentrációik eltérnek.
Példa munkafolyamat:
Enzimatikus tesztek esetén gyakran szükséges egy adott mennyiségű fehérjét használni a reakciós körülmények standardizálásához különböző minták vagy kísérletek között.
Példa munkafolyamat:
Immunprecipitációs (IP) kísérletek során fontos, hogy egy következetes mennyiségű fehérjét használjunk az eredmények összehasonlításához különböző körülmények között.
Példa munkafolyamat:
A fehérje tisztítás során gyakran szükséges nyomon követni a fehérje koncentrációját és a hozamokat különböző lépésekben.
Példa munkafolyamat:
Bár a kalkulátor alapértelmezett paramétereket biztosít a standard BCA tesztekhez, egyéni értékeket is megadhat, ha saját standard görbét készített. Ez különösen hasznos, ha:
Egy egyéni standard görbe használatához:
A kalkulátor lehetővé teszi, hogy több mintát adjon hozzá, és egyszerre számolja ki a térfogataikat. Ez különösen hasznos, amikor olyan kísérletekhez készít mintákat, amelyek következetes fehérje terhelést igényelnek több körülmény között.
A csoportos feldolgozás előnyei:
Ha az abszorbancia-értéke meghaladja a 2.0-t, lehet, hogy a BCA teszt lineáris tartományán kívül van. Ilyen esetekben:
Az abszorbancia-értékek <0.1 esetén közel lehet a teszt detektálási határához, ami befolyásolhatja a pontosságot. Fontolja meg:
Ha a kalkulátor olyan térfogatot javasol, amely túl nagy az alkalmazásához:
A fehérjék pontos mennyiségének meghatározása alapvető követelmény volt a biokémia és molekuláris biológia területén, amióta ezek a területek megjelentek. A korai módszerek a nitrogén tartalom meghatározására támaszkodtak, ami időigényes volt, és különleges felszerelést igényelt.
Kjeldahl Módszer (1883): Az egyik legkorábbi módszer a fehérje mennyiségének meghatározására, amely a nitrogén tartalom mérésén alapul.
Biuret Teszt (1900-as évek eleje): Ez a módszer a peptid kötések és rézionok reakciójára támaszkodik egy alkalikus oldatban, lila színt előidézve.
Lowry Teszt (1951): Oliver Lowry által kifejlesztett módszer, amely a Biuret reakciót a Folin-Ciocalteu reagenssel kombinálta, növelve az érzékenységet.
Bradford Teszt (1976): Marion Bradford fejlesztette ki ezt a módszert a Coomassie Brilliant Blue G-250 festék felhasználásával, amely a fehérjékhez kötődik, és eltolja az abszorpciós maximumot.
BCA Teszt (1985): Paul Smith és kollégái a Pierce Chemical Company-nál fejlesztették ki ezt a módszert, amely a Biuret reakciót a BCA detektálással ötvözte, javítva az érzékenységet és a detergensekkel való kompatibilitást.
A BCA tesztet először egy 1985-ös cikkben írták le Smith et al. "Measurement of protein using bicinchoninic acid." címmel. Azért fejlesztették ki, hogy orvosolja a meglévő módszerek korlátait, különösen a fehérje extrakció és tisztítás során gyakran használt vegyületek interferenciáját.
A kulcsinnováció a bicinchoninsav felhasználása volt a Cu¹⁺ ionok detektálására, amelyeket a fehérje által okozott Cu²⁺ redukció hoz létre, lila színű komplexet képezve, amelyet spektrofotométerrel lehet mérni. Ez számos előnyt biztosított:
Bevezetése óta a BCA teszt a legszélesebb körben használt fehérje mennyiség meghatározási módszerré vált a biokémiai és molekuláris biológiai laboratóriumokban világszerte.
1=IF(B2<=0,"Hiba: Érvénytelen abszorbancia",IF(C2<=0,"Hiba: Érvénytelen minta tömeg",C2/(2*B2)))
2
3' Ahol:
4' B2 tartalmazza az abszorbancia-értéket
5' C2 tartalmazza a kívánt minta tömeget μg-ban
6' A képlet visszaadja a szükséges minta térfogatot μL-ben
71import numpy as np
2import matplotlib.pyplot as plt
3
4def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=2.0, intercept=0):
5 """Számítsa ki a fehérje koncentrációt az abszorbanciából a standard görbe segítségével."""
6 if absorbance < 0:
7 raise ValueError("Az abszorbancia nem lehet negatív")
8 return (slope * absorbance) + intercept
9
10def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=2.0, intercept=0):
11 """Számítsa ki a szükséges minta térfogatot az abszorbancia és a kívánt tömeg alapján."""
12 if sample_mass <= 0:
13 raise ValueError("A minta tömegének pozitívnak kell lennie")
14
15 protein_concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if protein_concentration <= 0:
18 raise ValueError("A kiszámított fehérje koncentrációnak pozitívnak kell lennie")
19
20 return sample_mass / protein_concentration
21
22# Példa használat
23absorbance = 0.75
24sample_mass = 20 # μg
25slope = 2.0
26intercept = 0
27
28try:
29 volume = calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
30 print(f"Az abszorbancia {absorbance} és a kívánt fehérje tömeg {sample_mass} μg esetén:")
31 print(f"Fehérje koncentráció: {calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept):.2f} μg/μL")
32 print(f"Szükséges minta térfogat: {volume:.2f} μL")
33except ValueError as e:
34 print(f"Hiba: {e}")
351# Függvény a fehérje koncentráció kiszámítására az abszorbanciából
2calculate_protein_concentration <- function(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
3 if (absorbance < 0) {
4 stop("Az abszorbancia nem lehet negatív")
5 }
6 return((slope * absorbance) + intercept)
7}
8
9# Függvény a minta térfogatának kiszámítására
10calculate_sample_volume <- function(absorbance, sample_mass, slope = 2.0, intercept = 0) {
11 if (sample_mass <= 0) {
12 stop("A minta tömegének pozitívnak kell lennie")
13 }
14
15 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if (protein_concentration <= 0) {
18 stop("A kiszámított fehérje koncentrációnak pozitívnak kell lennie")
19 }
20
21 return(sample_mass / protein_concentration)
22}
23
24# Példa használat
25absorbance <- 0.75
26sample_mass <- 20 # μg
27slope <- 2.0
28intercept <- 0
29
30tryCatch({
31 volume <- calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
32 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
33
34 cat(sprintf("Az abszorbancia %.2f és a kívánt fehérje tömeg %.2f μg esetén:\n", absorbance, sample_mass))
35 cat(sprintf("Fehérje koncentráció: %.2f μg/μL\n", protein_concentration))
36 cat(sprintf("Szükséges minta térfogat: %.2f μL\n", volume))
37}, error = function(e) {
38 cat(sprintf("Hiba: %s\n", e$message))
39})
401function calculateProteinConcentration(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
2 if (absorbance < 0) {
3 throw new Error("Az abszorbancia nem lehet negatív");
4 }
5 return (slope * absorbance) + intercept;
6}
7
8function calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope = 2.0, intercept = 0) {
9 if (sampleMass <= 0) {
10 throw new Error("A minta tömegének pozitívnak kell lennie");
11 }
12
13 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
14
15 if (proteinConcentration <= 0) {
16 throw new Error("A kiszámított fehérje koncentrációnak pozitívnak kell lennie");
17 }
18
19 return sampleMass / proteinConcentration;
20}
21
22// Példa használat
23try {
24 const absorbance = 0.75;
25 const sampleMass = 20; // μg
26 const slope = 2.0;
27 const intercept = 0;
28
29 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
30 const volume = calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope, intercept);
31
32 console.log(`Az abszorbancia ${absorbance} és a kívánt fehérje tömeg ${sampleMass} μg esetén:`);
33 console.log(`Fehérje koncentráció: ${proteinConcentration.toFixed(2)} μg/μL`);
34 console.log(`Szükséges minta térfogat: ${volume.toFixed(2)} μL`);
35} catch (error) {
36 console.error(`Hiba: ${error.message}`);
37}
38Az abszorbancia és a fehérje koncentráció közötti kapcsolat általában lineáris egy bizonyos tartományon belül. Az alábbiakban egy standard BCA görbe vizualizációja látható:
<text x="150" y="370">0.5</text>
<line x1="150" y1="350" x2="150" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="250" y="370">1.0</text>
<line x1="250" y1="350" x2="250" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="350" y="370">1.5</text>
<line x1="350" y1="350" x2="350" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="450" y="370">2.0</text>
<line x1="450" y1="350" x2="450" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="550" y="370">2.5</text>
<line x1="550" y1="350" x2="550" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="300">1.0</text>
<line x1="45" y1="300" x2="50" y2="300" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="250">2.0</text>
<line x1="45" y1="250" x2="50" y2="250" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="200">3.0</text>
<line x1="45" y1="200" x2="50" y2="200" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="150">4.0</text>
<line x1="45" y1="150" x2="50" y2="150" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="100">5.0</text>
<line x1="45" y1="100" x2="50" y2="100" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="50">6.0</text>
<line x1="45" y1="50" x2="50" y2="50" stroke="#64748b"/>
Különböző fehérje mennyiség meghatározási módszereknek különböző előnyeik és korlátaik vannak. Íme, hogyan hasonlít a BCA teszt más gyakori módszerekhez:
| Módszer | Érzékenységi Tartomány | Előnyök | Korlátok | Legjobb |
|---|---|---|---|---|
| BCA Teszt | 5-2000 μg/mL | • Kompatibilis a detergensekkel • Kevesebb fehérje-fehérje variáció • Stabil színfejlődés | • Zavarhatják a redukáló szerek • Néhány chelátképző anyag által befolyásolt | • Általános fehérje mennyiség meghatározás • Detergens tartalmú minták |
| Bradford Teszt | 1-1500 μg/mL | • Gyors (2-5 perc) • Kevés zavaró anyag | • Magas fehérje-fehérje variáció • Kompatibilis a detergensekkel | • Gyors mérések • Detergens-mentes minták |
| Lowry Módszer | 1-1500 μg/mL | • Jól megalapozott • Jó érzékenység | • Sok zavaró anyag • Több lépés | • Történelmi konzisztencia • Tiszta fehérje minták |
| UV Absorbancia (280 nm) | 20-3000 μg/mL | • Nem destruktív • Nagyon gyors • Nincs szükség reagensre | • Nukleinsavak által befolyásolt • Tiszta minták szükségesek | • Tiszta fehérje oldatok • Gyors ellenőrzések a tisztítás során |
| Fluorometrikus | 0.1-500 μg/mL | • Legmagasabb érzékenység • Széles dinamikai tartomány | • Drága reagens • Fluorométer szükséges | • Nagyon híg minták • Korlátozott minta térfogat |
A BCA (bicinchoninsav) tesztet elsősorban a fehérje koncentrációjának meghatározására használják egy mintában. Széles körben alkalmazzák a biokémia, sejtbiológia és molekuláris biológia területén, olyan alkalmazásokban, mint a western blotting, enzimatikus tesztek, immunprecipitáció és fehérje tisztítás.
A BCA teszt általában 5-10% pontossággal működik, ha helyesen hajtják végre. A pontossága számos tényezőtől függ, beleértve a standard görbe minőségét, a zavaró anyagok hiányát, és hogy az ismeretlen fehérje összetétele hasonló-e a használt standard fehérjéhez.
Számos anyag zavarhatja a BCA teszt eredményeit, beleértve:
A fő különbségek:
Ha a kalkulátor nagyon nagy minta térfogatot mutat, az általában alacsony fehérje koncentrációt jelez az Ön mintájában. Ez lehet a következők miatt:
Fontolja meg a minta koncentrálását, vagy állítsa be a kísérleti tervét az alacsonyabb fehérje koncentrációhoz.
Ez a kalkulátor kifejezetten a BCA teszt eredményeire van tervezve. Bár az alapelv (koncentráció térfogatra váltása) más módszerekre is érvényes, az abszorbancia és a fehérje koncentráció közötti kapcsolat eltérő a különböző tesztek között. Más módszerekhez, mint a Bradford vagy Lowry, különböző standard görbe paramétereket kell használni.
Ha az abszorbancia-értékek a lineáris tartományon kívül esnek (tipikusan >2.0):
A Bovin Szérum Albumin (BSA) a leggyakrabban használt standard a BCA tesztekhez, mert:
Ha azonban a mintái jelentősen eltérnek a BSA-tól, fontolja meg, hogy azt a fehérjét használja standardként a pontosabb eredmények érdekében.
A BCA reakció során kifejlesztett lila szín stabil néhány órán át szobahőmérsékleten, és bármikor mérhető ezen időszak alatt. Azonban a legjobb eredmények érdekében ajánlott, hogy minden standardot és mintát körülbelül ugyanakkor mérjenek a színfejlődés után.
Bár technikailag lehetséges újra felhasználni egy standard görbét, nem ajánlott a megbízható mennyiség meghatározásához. A reagens, inkubációs körülmények és az eszköz kalibrálásában bekövetkező változások befolyásolhatják az abszorbancia és a fehérje koncentráció közötti kapcsolatot. Megbízható eredmények érdekében minden alkalommal friss standard görbét kell készíteni.
Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, et al. "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Analytical Biochemistry. 1985;150(1):76-85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7
Thermo Scientific. "Pierce BCA Protein Assay Kit." Utasítások. Elérhető: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf
Walker JM. "The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation." In: Walker JM, ed. The Protein Protocols Handbook. Springer; 2009:11-15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3
Olson BJ, Markwell J. "Assays for determination of protein concentration." Current Protocols in Protein Science. 2007;Chapter 3:Unit 3.4. doi:10.1002/0471140864.ps0304s48
Noble JE, Bailey MJ. "Quantitation of protein." Methods in Enzymology. 2009;463:73-95. doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1
Most, hogy megértette a BCA fehérje mennyiség meghatározásának és a minta térfogatának kiszámításának elveit, próbálja ki kalkulátorunkat, hogy egyszerűsítse laboratóriumi munkafolyamatát. Egyszerűen adja meg az abszorbancia-értékeket és a kívánt minta tömeget, hogy azonnali, pontos minta térfogat számításokat kapjon.
Akár mintákat készít western blottinghoz, enzimatikus tesztekhez, vagy bármely más fehérjealapú kísérlethez, kalkulátorunk segít biztosítani a következetes és megbízható eredményeket. Időt takarít meg, csökkenti a hibákat, és javítja kísérletei reprodukálhatóságát a BCA Absorbance Minta Térfogat Kalkulátorral.
Fedezzen fel több olyan eszközt, amely hasznos lehet a munkafolyamatához