Kalkulator Suhu Penempelan DNA | Alat Tm PCR Gratis

Apa itu kalkulator suhu annealing DNA?

Kalkulator suhu annealing DNA memperkirakan suhu leleh (Tm) primer DNA dari urutannya. Tm adalah suhu ketika separuh molekul primer terikat pada untai targetnya dan separuh lainnya tidak. Dalam reaksi berantai polimerase (PCR), nilai ini menjadi acuan suhu yang digunakan agar primer menempel pada templat DNA.

Mengapa suhu annealing penting dalam PCR

PCR menyalin bagian DNA target melalui siklus pemanasan dan pendinginan berulang. Setiap siklus memiliki tiga tahap. Pertama, pemanasan memisahkan templat untai ganda pada sekitar 95 °C. Tahap ini disebut denaturasi. Kedua, reaksi didinginkan hingga suhu annealing, biasanya antara 50 °C dan 65 °C, agar primer pendek dapat berikatan dengan urutan yang sesuai pada untai tunggal. Ketiga, suhu dinaikkan hingga sekitar 72 °C, dan enzim yang disebut DNA polimerase memanjangkan primer untuk membentuk untai DNA baru.

Jika suhu annealing terlalu rendah, primer berikatan dengan urutan yang hanya sebagian cocok sehingga menghasilkan fragmen DNA tambahan yang tidak diinginkan. Jika terlalu tinggi, primer tidak dapat membentuk ikatan yang stabil dengan templat, sehingga sedikit atau tidak ada DNA yang tersalin. Suhu annealing merupakan salah satu pengaturan pertama yang disesuaikan peneliti ketika reaksi PCR gagal.

Bagaimana kandungan GC memengaruhi Tm

Primer berpasangan dengan targetnya melalui ikatan hidrogen. Pasangan guanin-sitosin (G-C) membentuk tiga ikatan hidrogen. Pasangan adenin-timin (A-T) membentuk dua ikatan. Primer dengan lebih banyak basa G dan C memerlukan lebih banyak panas untuk dipisahkan, sehingga memiliki Tm lebih tinggi daripada primer dengan panjang sama yang memiliki lebih banyak basa A dan T. Kandungan GC biasanya ditulis sebagai persentase: jumlah basa G dan C dibagi panjang total urutan, lalu dikalikan 100.

Rumus suhu annealing DNA

Kalkulator ini menerapkan salah satu dari dua rumus, yang dipilih berdasarkan panjang primer.

Untuk primer dengan panjang 14 nukleotida atau lebih, kalkulator menggunakan rumus kandungan GC Marmur-Doty:

$Tm = 64.9 + 41 \times \frac{(N_{GC} - 16.4)}{N}$

Di sini N_GC adalah jumlah basa G dan C dalam primer, yang dihitung secara langsung, bukan sebagai persentase. N adalah jumlah total basa.

Untuk primer yang lebih pendek daripada 14 nukleotida, kalkulator menggunakan aturan Wallace:

$Tm = 2 \times (A + T) + 4 \times (G + C)$

A, T, G, dan C masing-masing menyatakan jumlah basa tersebut dalam primer.

Kedua rumus mengasumsikan kondisi standar yaitu primer 50 nanomolar, Na+ 50 milimolar, dan pH 7,0, dan titik peralihan pada 14 basa di antara keduanya mengikuti konvensi yang sama.

Contoh perhitungan

Ambil primer dengan 19 basa ATGCTAGCTAGCTGCTAGC. Panjangnya adalah 19, yaitu 14 atau lebih, sehingga kalkulator menggunakan rumus Marmur-Doty.

• Panjang (N) = 19
• Jumlah G = 5, jumlah C = 5, sehingga N_GC = 10
• Kandungan GC = 10 / 19 × 100 ≈ 52,6%
• Tm = 64,9 + 41 × (10 − 16,4) / 19
• Tm = 64,9 + 41 × (−6,4) / 19
• Tm = 64,9 − 13,8
• Tm ≈ 51,1 °C

Rumus tersebut menggunakan jumlah GC, 10, bukan persentase GC, 52,6. Menggunakan persentase secara keliru menghasilkan Tm sekitar 143 °C, yang bukan nilai realistis untuk reaksi PCR yang berlangsung antara 50 °C dan 95 °C.

Cara menggunakan kalkulator ini

Ketik atau tempel urutan primer dengan hanya menggunakan huruf A, T, G, dan C. Kalkulator menampilkan panjang urutan, kandungan GC dalam persen, dan suhu annealing hasil perhitungan. Hasilnya dapat disalin untuk catatan laboratorium atau protokol.

Memilih suhu annealing PCR

Tm adalah perkiraan hasil perhitungan, bukan suhu kerja yang dijamin. Banyak protokol memulai tahap annealing sebenarnya beberapa derajat di bawah Tm hasil perhitungan, lalu menyesuaikannya berdasarkan hasil pada gel. Untuk sepasang primer, nilai Tm yang lebih rendah dari kedua primer biasanya digunakan sebagai titik awal. PCR gradien, yang menjalankan beberapa reaksi pada berbagai suhu secara bersamaan, merupakan cara umum untuk menemukan suhu terbaik melalui pengujian.

Cara lain untuk memperkirakan Tm

Rumus Marmur-Doty dan Wallace yang digunakan di sini adalah pendekatan cepat yang hanya didasarkan pada komposisi basa. Metode lain juga tersedia:

• Termodinamika nearest-neighbor memperhitungkan bagaimana setiap pasangan basa yang bersebelahan memengaruhi stabilitas. Para penulis salah satu alat primer yang banyak digunakan menyebutnya sebagai metode yang lebih disukai untuk oligonukleotida sepanjang 8 hingga 40 basa.
• Rumus yang disesuaikan dengan kadar garam menambahkan koreksi berdasarkan konsentrasi ion Na+ atau K+ dalam dapar reaksi, karena konsentrasi garam yang lebih tinggi menstabilkan dupleks DNA dan meningkatkan Tm.

Kalkulator yang berbeda dapat melaporkan nilai Tm yang berbeda untuk primer yang sama karena menggunakan rumus yang berbeda. Menjalankan PCR dan memeriksa hasilnya tetap menjadi uji akhir.

Pertanyaan yang sering diajukan

Apa itu suhu annealing DNA?

Suhu annealing DNA adalah suhu ketika primer DNA berikatan dengan urutan yang sesuai pada untai templat selama PCR. Laboratorium biasanya menetapkannya beberapa derajat di bawah suhu leleh (Tm) primer hasil perhitungan.

Bagaimana Tm primer dihitung?

Untuk primer dengan 14 basa atau lebih, Tm = 64,9 + 41 × (jumlah GC − 16,4) / panjang. Untuk primer yang lebih pendek daripada 14 basa, Tm = 2 × (jumlah A+T) + 4 × (jumlah G+C).

Mengapa kandungan GC meningkatkan Tm?

Pasangan basa G-C membentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan pasangan A-T membentuk dua. Primer dengan proporsi basa G dan C yang lebih tinggi memerlukan lebih banyak energi, dan dengan demikian suhu yang lebih tinggi, untuk dipisahkan dari targetnya.

Haruskah suhu annealing PCR sama dengan Tm hasil perhitungan?

Tidak. Sebagian besar protokol dimulai beberapa derajat di bawah Tm hasil perhitungan dan kemudian disesuaikan, karena Tm menandai titik ketika hanya separuh primer yang terikat.

Apakah panjang primer mengubah Tm?

Ya, meskipun tidak secara sederhana. Panjang berada di penyebut rumus Marmur-Doty, sehingga primer yang lebih panjang dengan kandungan GC rata-rata tidak otomatis memiliki Tm lebih tinggi daripada primer yang lebih pendek dan kaya GC.

Mengapa kalkulator Tm yang berbeda memberikan hasil yang tidak sama?

Kalkulator tersebut menggunakan rumus yang berbeda. Aturan Wallace, rumus kandungan GC Marmur-Doty, termodinamika tetangga terdekat, dan rumus yang disesuaikan dengan kadar garam masing-masing dapat memberikan Tm yang berbeda untuk primer yang sama, terkadang terpaut beberapa derajat.

Referensi

1. ROSALIND. What formula is used to calculate Melting Temperature (Tm)? Pusat Pengetahuan ROSALIND — aturan Wallace untuk urutan di bawah 14 basa, Tm = 64,9 + 41 × (G + C − 16,4) / N untuk urutan yang lebih panjang, serta asumsi primer 50 nM, Na+ 50 mM, dan pH 7,0.
2. SantaLucia J Jr. A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. PMC19045 — model nearest-neighbor, yang menjumlahkan kontribusi dari setiap pasangan basa yang bersebelahan.
3. Kibbe WA. OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator. Nucleic Acids Research, 2007. PMC1933198 — metode nearest-neighbor lebih disukai untuk oligonukleotida sepanjang 8 hingga 40 nt; rumus dasar adalah yang paling tidak disukai.