Kalkulator Ligation DNA

Pendahuluan

Ligation DNA adalah teknik biologi molekuler yang penting digunakan untuk menggabungkan fragmen DNA bersama dengan ikatan kovalen. Kalkulator Ligation DNA adalah alat yang penting bagi para peneliti, membantu menentukan jumlah optimal dari DNA vektor dan penyisipan yang diperlukan untuk reaksi ligasi yang berhasil. Dengan menghitung rasio molar yang benar antara DNA vektor (plasmid) dan fragmen DNA penyisipan, kalkulator ini memastikan eksperimen kloning molekuler yang efisien sambil meminimalkan pemborosan reagen dan reaksi yang gagal.

Reaksi ligasi adalah dasar dari rekayasa genetik, biologi sintetis, dan prosedur kloning molekuler. Mereka memungkinkan ilmuwan untuk membuat molekul DNA rekombinan dengan menyisipkan gen yang menarik ke dalam vektor plasmid untuk transformasi selanjutnya ke dalam organisme inang. Keberhasilan reaksi ini sangat bergantung pada penggunaan jumlah komponen DNA yang sesuai, yang merupakan hal yang dibantu oleh kalkulator ini.

Apakah Anda sedang membangun vektor ekspresi, membuat pustaka gen, atau melakukan subkloning rutin, kalkulator ligasi DNA ini akan membantu Anda mengoptimalkan kondisi eksperimen Anda dan meningkatkan tingkat keberhasilan Anda. Dengan memasukkan beberapa parameter kunci tentang sampel DNA Anda, Anda dapat dengan cepat memperoleh volume yang tepat yang diperlukan untuk reaksi ligasi spesifik Anda.

Formula/Perhitungan

Kalkulator ligasi DNA menggunakan rumus biologi molekuler dasar yang memperhitungkan ukuran dan konsentrasi yang berbeda dari fragmen DNA yang akan digabungkan. Perhitungan utama menentukan seberapa banyak DNA penyisipan yang diperlukan relatif terhadap DNA vektor berdasarkan panjang masing-masing dan rasio molar yang diinginkan.

Perhitungan Jumlah Penyisipan

Jumlah DNA penyisipan yang dibutuhkan (dalam nanogram) dihitung menggunakan rumus berikut:

$\text{ng penyisipan} = \text{ng vektor} \times \frac{\text{ukuran kb penyisipan}}{\text{ukuran kb vektor}} \times \text{rasio molar}$

Di mana:

• ng vektor = jumlah DNA vektor yang digunakan dalam reaksi (biasanya 50-100 ng)
• ukuran kb penyisipan = panjang fragmen DNA penyisipan dalam kilobase (kb)
• ukuran kb vektor = panjang DNA vektor dalam kilobase (kb)
• rasio molar = rasio yang diinginkan dari molekul penyisipan ke molekul vektor (biasanya 3:1 hingga 5:1)

Perhitungan Volume

Setelah jumlah DNA penyisipan yang diperlukan ditentukan, volume yang dibutuhkan untuk reaksi dihitung:

$\text{Volume vektor (μL)} = \frac{\text{ng vektor}}{\text{konsentrasi vektor (ng/μL)}}$

$\text{Volume penyisipan (μL)} = \frac{\text{ng penyisipan}}{\text{konsentrasi penyisipan (ng/μL)}}$

$\text{Volume buffer/air (μL)} = \text{Total volume reaksi (μL)} - \text{Volume vektor (μL)} - \text{Volume penyisipan (μL)}$

Contoh Perhitungan

Mari kita melalui contoh praktis:

• Konsentrasi vektor: 50 ng/μL
• Panjang vektor: 3000 bp (3 kb)
• Konsentrasi penyisipan: 25 ng/μL
• Panjang penyisipan: 1000 bp (1 kb)
• Rasio molar yang diinginkan (penyisipan:vektor): 3:1
• Volume reaksi total: 20 μL
• Jumlah vektor yang akan digunakan: 50 ng

Langkah 1: Hitung jumlah penyisipan yang diperlukan $\text{ng penyisipan} = 50 \text{ ng} \times \frac{1 \text{ kb}}{3 \text{ kb}} \times 3 = 50 \times 0.33 \times 3 = 50 \text{ ng}$

Langkah 2: Hitung volume $\text{Volume vektor} = \frac{50 \text{ ng}}{50 \text{ ng/μL}} = 1 \text{ μL}$

$\text{Volume penyisipan} = \frac{50 \text{ ng}}{25 \text{ ng/μL}} = 2 \text{ μL}$

$\text{Volume buffer/air} = 20 \text{ μL} - 1 \text{ μL} - 2 \text{ μL} = 17 \text{ μL}$

Perhitungan ini memastikan bahwa ada tiga molekul penyisipan untuk setiap molekul vektor dalam reaksi, mengoptimalkan peluang keberhasilan ligasi.

Panduan Langkah-demi-Langkah untuk Menggunakan Kalkulator

Kalkulator Ligation DNA kami dirancang agar intuitif dan sederhana. Ikuti langkah-langkah ini untuk menghitung volume optimal untuk reaksi ligasi Anda:

1. Masukkan Informasi Vektor:

   • Masukkan konsentrasi vektor Anda dalam ng/μL
   • Masukkan panjang vektor dalam pasangan basa (bp)
   • Tentukan jumlah DNA vektor yang ingin Anda gunakan dalam reaksi (ng)

2. Masukkan Informasi Penyisipan:

   • Masukkan konsentrasi penyisipan Anda dalam ng/μL
   • Masukkan panjang penyisipan dalam pasangan basa (bp)

3. Atur Parameter Reaksi:

   • Tentukan rasio molar yang diinginkan (penyisipan:vektor) - biasanya antara 3:1 dan 5:1
   • Masukkan volume reaksi total dalam μL (biasanya 10-20 μL)

4. Lihat Hasil:

   • Kalkulator akan secara otomatis menampilkan:
     • Volume vektor yang diperlukan (μL)
     • Volume penyisipan yang diperlukan (μL)
     • Volume buffer/air yang harus ditambahkan (μL)
     • Total volume reaksi (μL)
     • Jumlah DNA vektor dan penyisipan dalam reaksi (ng)

5. Salin Hasil (opsional):

   • Gunakan tombol "Salin Hasil" untuk menyalin semua perhitungan ke clipboard Anda untuk buku catatan lab atau protokol Anda

Kalkulator melakukan pemeriksaan validasi untuk memastikan semua input adalah angka positif dan bahwa total volume cukup untuk volume DNA yang diperlukan. Jika ada kesalahan yang terdeteksi, pesan kesalahan yang membantu akan membimbing Anda untuk memperbaiki input.

Kasus Penggunaan

Kalkulator Ligation DNA sangat berharga di berbagai aplikasi biologi molekuler:

Kloning Molekuler

Kasus penggunaan yang paling umum adalah kloning molekuler standar, di mana para peneliti menyisipkan gen atau fragmen DNA ke dalam vektor plasmid. Kalkulator memastikan kondisi optimal untuk:

• Subkloning gen antara berbagai vektor ekspresi
• Membuat protein fusi dengan menggabungkan beberapa fragmen gen
• Membangun uji gen pelapor
• Membangun pustaka plasmid

Biologi Sintetis

Dalam biologi sintetis, di mana beberapa fragmen DNA sering dirakit:

• Reaksi Gibson Assembly mendapat manfaat dari rasio penyisipan:vektor yang tepat
• Sistem perakitan Golden Gate memerlukan konsentrasi DNA yang spesifik
• Perakitan BioBrick dari bagian genetik yang distandarisasi
• Konstruksi rangkaian genetik sintetis

Pengembangan Kit Diagnostik

Saat mengembangkan alat diagnostik molekuler:

• Kloning penanda genetik spesifik penyakit
• Konstruksi plasmid kontrol positif
• Pengembangan standar kalibrasi untuk qPCR

Sistem Ekspresi Protein

Untuk para peneliti yang bekerja pada produksi protein:

• Mengoptimalkan rasio penyisipan:vektor untuk vektor ekspresi salinan tinggi
• Konstruksi sistem ekspresi yang dapat diinduksi
• Membuat vektor sekresi untuk pemurnian protein

Aplikasi CRISPR-Cas9

Dalam aplikasi pengeditan genom:

• Kloning RNA panduan ke dalam vektor CRISPR
• Membuat template donor untuk perbaikan yang diarahkan homologi
• Membangun pustaka RNA panduan untuk penyaringan

Ligasi yang Menantang

Kalkulator ini sangat berharga untuk skenario ligasi yang menantang:

• Kloning penyisipan besar (>5 kb)
• Penyisipan fragmen yang sangat kecil (<100 bp)
• Ligasi ujung tumpul yang memiliki efisiensi lebih rendah
• Reaksi perakitan multi-fragmen

Alternatif

Sementara Kalkulator Ligation DNA kami memberikan perhitungan yang tepat untuk reaksi ligasi tradisional, beberapa pendekatan alternatif ada untuk menggabungkan fragmen DNA:

1. Gibson Assembly: Menggunakan exonuclease, polimerase, dan ligase dalam reaksi satu tabung untuk menggabungkan fragmen DNA yang tumpang tindih. Tidak ada perhitungan ligasi tradisional yang diperlukan, tetapi rasio konsentrasi tetap penting.

2. Golden Gate Assembly: Menggunakan enzim restriksi Tipe IIS untuk perakitan arah, tanpa bekas dari beberapa fragmen. Memerlukan jumlah yang setara dari semua fragmen.

3. SLIC (Sequence and Ligation Independent Cloning): Menggunakan exonuclease untuk membuat overhang untai tunggal yang berikatan bersama. Biasanya menggunakan rasio yang setara dari fragmen.

4. In-Fusion Cloning: Sistem komersial yang memungkinkan penggabungan fragmen dengan tumpang tindih 15 bp. Menggunakan rasio tertentu berdasarkan ukuran fragmen.

5. Gateway Cloning: Menggunakan rekombinasi spesifik situs alih-alih ligasi. Memerlukan vektor masuk dan tujuan yang spesifik.

6. Pengujian Empiris: Beberapa laboratorium lebih suka menyiapkan beberapa reaksi ligasi dengan rasio penyisipan:vektor yang berbeda (1:1, 3:1, 5:1, 10:1) dan menentukan mana yang bekerja terbaik untuk konstruksi spesifik mereka.

7. Kalkulator Perangkat Lunak: Paket perangkat lunak komersial seperti Vector NTI dan SnapGene mencakup kalkulator ligasi dengan fitur tambahan seperti analisis situs restriksi.

Sejarah

Pengembangan perhitungan ligasi DNA sejalan dengan evolusi teknik kloning molekuler, yang telah merevolusi biologi molekuler dan bioteknologi.

Pengembangan Awal (1970-an)

Konsep ligasi DNA untuk kloning molekuler muncul pada awal 1970-an dengan pekerjaan perintis Paul Berg, Herbert Boyer, dan Stanley Cohen, yang mengembangkan molekul DNA rekombinan pertama. Selama periode ini, reaksi ligasi sebagian besar bersifat empiris, dengan para peneliti menggunakan percobaan dan kesalahan untuk menentukan kondisi optimal.

Penemuan enzim restriksi dan DNA ligase menyediakan alat penting untuk memotong dan menyambung molekul DNA. T4 DNA ligase, yang diisolasi dari E. coli yang terinfeksi fag T4, menjadi enzim standar untuk menggabungkan fragmen DNA karena kemampuannya untuk meligasi ujung tumpul dan koheren.

Periode Penyempurnaan (1980-an-1990-an)

Seiring kloning molekuler menjadi lebih rutin, para peneliti mulai mengembangkan pendekatan yang lebih sistematis untuk reaksi ligasi. Pentingnya rasio molar antara DNA vektor dan penyisipan menjadi jelas, yang mengarah pada pengembangan rumus dasar yang masih digunakan hingga saat ini.

Selama periode ini, para peneliti menetapkan bahwa kelebihan DNA penyisipan (biasanya rasio molar 3:1 hingga 5:1) umumnya meningkatkan efisiensi ligasi untuk aplikasi kloning standar. Pengetahuan ini awalnya dibagikan melalui protokol laboratorium dan secara bertahap masuk ke dalam manual dan buku teks biologi molekuler.

Era Modern (2000-an-Sekarang)

Kemunculan alat komputasi dan kalkulator online pada tahun 2000-an membuat perhitungan ligasi yang tepat lebih mudah diakses oleh para peneliti. Seiring teknik biologi molekuler menjadi lebih canggih, kebutuhan akan perhitungan yang akurat menjadi lebih kritis, terutama untuk proyek kloning yang menantang yang melibatkan beberapa fragmen atau penyisipan besar.

Saat ini, perhitungan ligasi DNA adalah bagian integral dari alur kerja kloning molekuler, dengan kalkulator khusus seperti ini membantu para peneliti mengoptimalkan eksperimen mereka. Rumus dasar telah tetap sebagian besar tidak berubah, meskipun pemahaman kita tentang faktor-faktor yang mempengaruhi efisiensi ligasi telah meningkat.

Kemunculan metode kloning alternatif seperti Gibson Assembly dan perakitan Golden Gate telah memperkenalkan kebutuhan perhitungan baru, tetapi konsep dasar rasio molar antara fragmen DNA tetap penting di seluruh teknik ini.

Contoh Kode

Berikut adalah implementasi kalkulator ligasi DNA dalam berbagai bahasa pemrograman:

1' Fungsi VBA Excel untuk Kalkulator Ligation DNA
2Function CalculateInsertAmount(vectorAmount As Double, vectorLength As Double, insertLength As Double, molarRatio As Double) As Double
3    ' Hitung jumlah penyisipan yang diperlukan dalam ng
4    CalculateInsertAmount = vectorAmount * (insertLength / vectorLength) * molarRatio
5End Function
6
7Function CalculateVectorVolume(vectorAmount As Double, vectorConcentration As Double) As Double
8    ' Hitung volume vektor dalam μL
9    CalculateVectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration
10End Function
11
12Function CalculateInsertVolume(insertAmount As Double, insertConcentration As Double) As Double
13    ' Hitung volume penyisipan dalam μL
14    CalculateInsertVolume = insertAmount / insertConcentration
15End Function
16
17Function CalculateBufferVolume(totalVolume As Double, vectorVolume As Double, insertVolume As Double) As Double
18    ' Hitung volume buffer/air dalam μL
19    CalculateBufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume
20End Function
21
22' Contoh penggunaan dalam sel:
23' =CalculateInsertAmount(50, 3000, 1000, 3)
24

1def calculate_ligation_volumes(vector_concentration, vector_length, insert_concentration, 
2                              insert_length, molar_ratio, total_volume, vector_amount=50):
3    """
4    Hitung volume untuk reaksi ligasi DNA.
5    
6    Parameter:
7    vector_concentration (float): Konsentrasi DNA vektor dalam ng/μL
8    vector_length (float): Panjang DNA vektor dalam pasangan basa
9    insert_concentration (float): Konsentrasi DNA penyisipan dalam ng/μL
10    insert_length (float): Panjang DNA penyisipan dalam pasangan basa
11    molar_ratio (float): Rasio molar yang diinginkan dari penyisipan:vektor
12    total_volume (float): Volume reaksi total dalam μL
13    vector_amount (float): Jumlah DNA vektor yang akan digunakan dalam ng (default: 50)
14    
15    Mengembalikan:
16    dict: Kamus yang berisi volume dan jumlah yang dihitung
17    """
18    # Hitung volume vektor
19    vector_volume = vector_amount / vector_concentration
20    
21    # Hitung jumlah penyisipan yang diperlukan
22    vector_length_kb = vector_length / 1000
23    insert_length_kb = insert_length / 1000
24    insert_amount = (vector_amount * insert_length_kb / vector_length_kb) * molar_ratio
25    
26    # Hitung volume penyisipan
27    insert_volume = insert_amount / insert_concentration
28    
29    # Hitung volume buffer/water
30    buffer_volume = total_volume - vector_volume - insert_volume
31    
32    return {
33        "vector_volume": round(vector_volume, 2),
34        "insert_volume": round(insert_volume, 2),
35        "buffer_volume": round(buffer_volume, 2),
36        "insert_amount": round(insert_amount, 2),
37        "vector_amount": vector_amount
38    }
39
40# Contoh penggunaan
41result = calculate_ligation_volumes(
42    vector_concentration=50,
43    vector_length=3000,
44    insert_concentration=25,
45    insert_length=1000,
46    molar_ratio=3,
47    total_volume=20
48)
49
50print(f"Vektor: {result['vector_volume']} μL ({result['vector_amount']} ng)")
51print(f"Penyisipan: {result['insert_volume']} μL ({result['insert_amount']} ng)")
52print(f"Buffer: {result['buffer_volume']} μL")
53print(f"Total: 20 μL")
54

1function calculateLigationVolumes(vectorConcentration, vectorLength, insertConcentration, 
2                                insertLength, molarRatio, totalVolume, vectorAmount = 50) {
3  // Konversi panjang ke kb untuk perhitungan
4  const vectorLengthKb = vectorLength / 1000;
5  const insertLengthKb = insertLength / 1000;
6  
7  // Hitung jumlah penyisipan yang diperlukan
8  const insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
9  
10  // Hitung volume
11  const vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
12  const insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
13  const bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
14  
15  return {
16    vectorVolume: parseFloat(vectorVolume.toFixed(2)),
17    insertVolume: parseFloat(insertVolume.toFixed(2)),
18    bufferVolume: parseFloat(bufferVolume.toFixed(2)),
19    insertAmount: parseFloat(insertAmount.toFixed(2)),
20    vectorAmount: vectorAmount
21  };
22}
23
24// Contoh penggunaan
25const result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
26console.log(`Vektor: ${result.vectorVolume} μL (${result.vectorAmount} ng)`);
27console.log(`Penyisipan: ${result.insertVolume} μL (${result.insertAmount} ng)`);
28console.log(`Buffer: ${result.bufferVolume} μL`);
29console.log(`Total: 20 μL`);
30

1public class DNALigationCalculator {
2    public static class LigationResult {
3        public final double vectorVolume;
4        public final double insertVolume;
5        public final double bufferVolume;
6        public final double insertAmount;
7        public final double vectorAmount;
8        
9        public LigationResult(double vectorVolume, double insertVolume, double bufferVolume, 
10                             double insertAmount, double vectorAmount) {
11            this.vectorVolume = vectorVolume;
12            this.insertVolume = insertVolume;
13            this.bufferVolume = bufferVolume;
14            this.insertAmount = insertAmount;
15            this.vectorAmount = vectorAmount;
16        }
17    }
18    
19    public static LigationResult calculateLigationVolumes(
20            double vectorConcentration, double vectorLength, 
21            double insertConcentration, double insertLength,
22            double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount) {
23        
24        // Konversi panjang ke kb
25        double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
26        double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
27        
28        // Hitung jumlah penyisipan yang diperlukan
29        double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
30        
31        // Hitung volume
32        double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
33        double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
34        double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
35        
36        // Bulatkan ke 2 desimal
37        vectorVolume = Math.round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
38        insertVolume = Math.round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
39        bufferVolume = Math.round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
40        insertAmount = Math.round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
41        
42        return new LigationResult(vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount);
43    }
44    
45    public static void main(String[] args) {
46        LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20, 50);
47        
48        System.out.printf("Vektor: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.vectorVolume, result.vectorAmount);
49        System.out.printf("Penyisipan: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.insertVolume, result.insertAmount);
50        System.out.printf("Buffer: %.2f μL%n", result.bufferVolume);
51        System.out.printf("Total: 20 μL%n");
52    }
53}
54

1#include <iostream>
2#include <cmath>
3#include <iomanip>
4
5struct LigationResult {
6    double vectorVolume;
7    double insertVolume;
8    double bufferVolume;
9    double insertAmount;
10    double vectorAmount;
11};
12
13LigationResult calculateLigationVolumes(
14    double vectorConcentration, double vectorLength,
15    double insertConcentration, double insertLength,
16    double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount = 50.0) {
17    
18    // Konversi panjang ke kb
19    double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
20    double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
21    
22    // Hitung jumlah penyisipan yang diperlukan
23    double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
24    
25    // Hitung volume
26    double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
27    double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
28    double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
29    
30    // Bulatkan ke 2 desimal
31    vectorVolume = std::round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
32    insertVolume = std::round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
33    bufferVolume = std::round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
34    insertAmount = std::round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
35    
36    return {vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount};
37}
38
39int main() {
40    LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
41    
42    std::cout << std::fixed << std::setprecision(2);
43    std::cout << "Vektor: " << result.vectorVolume << " μL (" << result.vectorAmount << " ng)" << std::endl;
44    std::cout << "Penyisipan: " << result.insertVolume << " μL (" << result.insertAmount << " ng)" << std::endl;
45    std::cout << "Buffer: " << result.bufferVolume << " μL" << std::endl;
46    std::cout << "Total: 20 μL" << std::endl;
47    
48    return 0;
49}
50

Pertanyaan yang Sering Diajukan (FAQ)

Apa rasio molar optimal untuk ligasi DNA?

Rasio molar optimal antara penyisipan dan vektor biasanya berkisar antara 3:1 hingga 5:1 untuk aplikasi ligasi standar. Namun, ini dapat bervariasi tergantung pada skenario ligasi spesifik:

• Untuk ligasi ujung koheren: 1:1 hingga 3:1
• Untuk ligasi ujung tumpul: 3:1 hingga 5:1
• Untuk penyisipan besar (>10 kb): 1:1 hingga 2:1
• Untuk penyisipan kecil (<500 bp): 5:1 hingga 10:1
• Untuk perakitan multi-fragmen: 3:1 untuk setiap penyisipan ke vektor

Mengapa reaksi ligasi saya gagal meskipun menggunakan volume yang dihitung?

Beberapa faktor dapat mempengaruhi efisiensi ligasi di luar rasio molar:

1. Kualitas DNA: Pastikan baik vektor maupun penyisipan memiliki ujung yang bersih tanpa kerusakan
2. Dephosphorylation: Periksa apakah vektor Anda telah didephosphorylasi, yang mencegah ligasi sendiri
3. Aktivitas enzim: Verifikasi bahwa ligase Anda aktif dan digunakan pada suhu yang benar
4. Waktu inkubasi: Beberapa ligasi mendapat manfaat dari inkubasi lebih lama (semalaman pada 16°C)
5. Kondisi buffer: Pastikan buffer yang benar dengan ATP digunakan
6. Kontaminan: Purifikasi DNA untuk menghilangkan penghambat seperti EDTA atau garam tinggi

Berapa banyak DNA vektor yang harus saya gunakan dalam reaksi ligasi?

Biasanya, 50-100 ng DNA vektor disarankan untuk reaksi ligasi standar. Menggunakan terlalu banyak vektor dapat menyebabkan latar belakang yang lebih tinggi dari vektor yang tidak terpotong atau ligasi sendiri, sedangkan terlalu sedikit dapat mengurangi efisiensi transformasi. Untuk ligasi yang menantang, Anda mungkin perlu mengoptimalkan jumlah ini.

Haruskah saya menyesuaikan perhitungan untuk ligasi ujung tumpul dibandingkan dengan ujung koheren?

Ya. Ligasi ujung tumpul umumnya kurang efisien dibandingkan ligasi ujung koheren. Untuk ligasi ujung tumpul, gunakan:

• Rasio molar yang lebih tinggi (3:1 hingga 5:1 atau bahkan lebih tinggi)
• Lebih banyak T4 DNA ligase (biasanya 2-3 kali lebih banyak)
• Waktu inkubasi yang lebih lama
• Pertimbangkan menambahkan PEG untuk meningkatkan efisiensi ligasi

Bagaimana cara saya menghitung ligasi untuk beberapa penyisipan?

Untuk perakitan beberapa fragmen:

1. Hitung setiap jumlah penyisipan secara individual menggunakan rumus yang sama
2. Pertahankan total rasio molar yang sama (misalnya, untuk dua penyisipan, gunakan 1.5:1.5:1 penyisipan1:penyisipan2:vektor)
3. Sesuaikan volume reaksi total untuk mengakomodasi semua fragmen DNA
4. Pertimbangkan ligasi berurutan atau menggunakan metode perakitan seperti Gibson Assembly untuk beberapa fragmen

Dapatkah saya menggunakan kalkulator ini untuk Gibson Assembly atau Golden Gate Assembly?

Kalkulator ini dirancang khusus untuk kloning berbasis enzim restriksi dan ligase tradisional. Untuk Gibson Assembly, jumlah yang setara dari semua fragmen biasanya disarankan (rasio 1:1), meskipun perhitungan dasar jumlah DNA berdasarkan panjang mirip. Untuk Golden Gate Assembly, rasio yang setara dari semua komponen juga biasanya digunakan.

Bagaimana saya harus memperhitungkan dephosphorylation vektor dalam perhitungan saya?

Dephosphorylation vektor (menghapus kelompok fosfat 5') mencegah ligasi sendiri tetapi tidak mengubah perhitungan jumlah. Namun, untuk vektor yang didephosphorylasi:

1. Gunakan DNA penyisipan yang segar dengan fosfat 5' yang utuh
2. Pertimbangkan menggunakan rasio penyisipan:vektor yang sedikit lebih tinggi (4:1 hingga 6:1)
3. Pastikan waktu ligasi yang lebih lama (setidaknya 1 jam pada suhu kamar atau semalaman pada 16°C)

Apa volume reaksi total minimum yang harus saya gunakan?

Volume reaksi praktis minimum biasanya sekitar 10 μL, yang memungkinkan pencampuran yang memadai dan mencegah masalah penguapan. Jika volume DNA yang dihitung melebihi volume reaksi yang diinginkan, Anda memiliki beberapa opsi:

1. Gunakan sampel DNA yang lebih terkonsentrasi
2. Turunkan jumlah vektor yang digunakan (misalnya, 25 ng alih-alih 50 ng)
3. Tingkatkan volume reaksi total
4. Pertimbangkan untuk mengkonsentrasikan sampel DNA Anda

Berapa lama saya harus menginkubasi reaksi ligasi saya?

Waktu inkubasi optimal bervariasi berdasarkan jenis ligasi:

• Ligasi ujung koheren: 1 jam pada suhu kamar (22-25°C) atau 4-16 jam pada 16°C
• Ligasi ujung tumpul: 2-4 jam pada suhu kamar atau semalaman (12-16 jam) pada 16°C
• Ligasi cepat (menggunakan ligase konsentrasi tinggi): 5-15 menit pada suhu kamar

Dapatkah saya menggunakan sisa reaksi ligasi untuk transformasi?

Ya, campuran ligasi biasanya dapat disimpan pada -20°C dan digunakan kembali untuk transformasi. Namun, setiap siklus beku-cair dapat mengurangi efisiensi. Untuk hasil terbaik:

1. Aliquot campuran ligasi sebelum membekukan
2. Inaktivasi panas ligase (65°C selama 10 menit) sebelum penyimpanan
3. Gunakan dalam waktu 1-2 bulan untuk hasil optimal

Referensi

1. Sambrook J, Russell DW. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (edisi ke-3). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

2. Green MR, Sambrook J. (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (edisi ke-4). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

3. Engler C, Kandzia R, Marillonnet S. (2008). A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS ONE, 3(11), e3647. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003647

4. Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. (2009). Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods, 6(5), 343-345. https://doi.org/10.1038/nmeth.1318

5. Aslanidis C, de Jong PJ. (1990). Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research, 18(20), 6069-6074. https://doi.org/10.1093/nar/18.20.6069

6. Zimmerman SB, Pheiffer BH. (1983). Macromolecular crowding allows blunt-end ligation by DNA ligases from rat liver or Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences, 80(19), 5852-5856. https://doi.org/10.1073/pnas.80.19.5852

7. Addgene - Referensi Biologi Molekuler. https://www.addgene.org/mol-bio-reference/

8. New England Biolabs (NEB) - Protokol Ligation DNA. https://www.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202

9. Thermo Fisher Scientific - Referensi Teknik Kloning Molekuler. https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center.html

10. Promega - Manual Teknik Kloning. https://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/cloning/