Kalkulator Ligasi DNA - Hitung Rasio Insert:Vektor untuk Kloning Molekuler

Ligasi DNA adalah tahap dalam kloning molekuler ketika fragmen sisipan disambungkan ke vektor plasmid oleh enzim ligase DNA T4. Kalkulator ligasi DNA menghitung berapa mikroliter DNA sisipan dan DNA vektor yang harus dicampurkan agar reaksi mencapai rasio molar sisipan terhadap vektor yang dipilih.

Fungsi kalkulator

Kalkulator ini menggunakan enam masukan: konsentrasi vektor, panjang vektor, konsentrasi sisipan, panjang sisipan, rasio molar target sisipan terhadap vektor, dan volume total reaksi. Kalkulator ini juga memungkinkan pengguna menetapkan jumlah DNA vektor yang digunakan, yang secara bawaan adalah 50 nanogram (ng). Dari nilai-nilai tersebut, kalkulator menghitung volume vektor yang harus dipipet, volume sisipan yang harus dipipet, serta volume dapar atau air yang perlu ditambahkan untuk mencapai volume total reaksi.

Konsentrasi diukur dalam nanogram per mikroliter (ng/μL), biasanya dibaca dari instrumen Nanodrop atau Qubit. Panjang diukur dalam pasangan basa (bp). Satu kilobasa (kb) sama dengan 1000 pasangan basa. Rasio molar menyatakan berapa banyak molekul sisipan yang harus ada untuk setiap satu molekul vektor. Rasio ini bukan rasio massa.

Mengapa digunakan rasio molar, bukan massa

Massa DNA yang sama tidak mengandung jumlah molekul yang sama. Sisipan pendek memiliki bobot lebih kecil daripada vektor panjang dengan jumlah molekul yang sama. Mencampurkan jumlah nanogram yang sama dari sisipan pendek dan vektor panjang akan menghasilkan terlalu sedikit molekul sisipan dibandingkan dengan molekul vektor. Kalkulator menyesuaikan massa sisipan berdasarkan rasio panjang fragmen, sehingga campuran akhir memiliki jumlah molekul sisipan yang diinginkan untuk setiap molekul vektor.

Rumus ligasi DNA

Jumlah DNA sisipan yang diperlukan, dalam nanogram, adalah:

$m_i = m_v \times \frac{k_i}{k_v} \times R$

di mana $m_i$ adalah jumlah sisipan dalam nanogram, $m_v$ jumlah vektor dalam nanogram, $k_i$ panjang sisipan dalam kilobasa, $k_v$ panjang vektor dalam kilobasa, dan R adalah rasio molar target sisipan terhadap vektor.

Setelah jumlah tersebut diketahui, kalkulator mengonversi setiap jumlah menjadi volume yang dapat dipipet:

$V_v = \frac{m_v}{c_v}$

$V_i = \frac{m_i}{c_i}$

$V_b = V_t - V_v - V_i$

di mana $V_v$ dan $V_i$ adalah volume vektor dan sisipan dalam mikroliter, $c_v$ dan $c_i$ adalah konsentrasi vektor dan sisipan dalam nanogram per mikroliter, $V_b$ adalah volume buffer, dan $V_t$ volume total reaksi.

Jika volume vektor dan sisipan secara keseluruhan lebih besar daripada volume total reaksi, tidak ada ruang tersisa untuk dapar, ligase, atau air. Dalam kasus tersebut, kalkulator melaporkan bahwa volume total terlalu kecil, bukan menampilkan jumlah dapar negatif.

Contoh perhitungan

Seorang peneliti mengklon fragmen gen 1 kb ke dalam vektor plasmid 3 kb. Rencananya adalah menggunakan 50 ng DNA vektor dengan rasio molar sisipan:vektor sebesar 3:1, dalam reaksi 20 μL.

Masukan:

• Konsentrasi vektor: 50 ng/μL
• Panjang vektor: 3000 bp (3 kb)
• Konsentrasi sisipan: 25 ng/μL
• Panjang sisipan: 1000 bp (1 kb)
• Rasio molar: 3
• Volume total: 20 μL
• Jumlah vektor: 50 ng

Langkah 1: jumlah sisipan

ng sisipan = 50 × (1 ÷ 3) × 3 = 50 ng

Langkah 2: volume

Volume vektor = 50 ng ÷ 50 ng/μL = 1 μL

Volume sisipan = 50 ng ÷ 25 ng/μL = 2 μL

Volume dapar = 20 − 1 − 2 = 17 μL

Reaksi tersebut terdiri atas 1 μL vektor, 2 μL sisipan, dan 17 μL dapar atau air, yang juga menjadi tempat penambahan ligase dan dapar reaksinya. Campuran ini menghasilkan tiga molekul sisipan untuk setiap molekul vektor.

Rasio molar yang umum untuk ligasi

Sebagian besar kloning standar dengan ujung lekat yang menonjol menggunakan rasio sisipan terhadap vektor sebesar 3:1. Ligasi yang menyambungkan ujung tumpul kurang efisien, sehingga rasio yang lebih tinggi, seperti 5:1, umum digunakan. Sisipan yang sangat besar terkadang bekerja lebih baik dengan rasio yang lebih rendah, mendekati 1:1, karena fragmen besar sudah menyumbang banyak pasangan basa per molekul.

Pertanyaan yang sering diajukan

Apa yang dimaksud dengan ligasi DNA?

Ligasi DNA adalah penyambungan dua fragmen DNA, biasanya vektor plasmid dan sisipan, menjadi satu molekul kontinu. Enzim ligase DNA T4 menyegel sambungan antara ujung-ujung fragmen tersebut.

Apa arti rasio molar sisipan:vektor?

Rasio ini adalah jumlah molekul DNA sisipan yang ada untuk setiap satu molekul vektor dalam reaksi. Rasio 3:1 berarti tiga molekul sisipan untuk setiap molekul vektor, terlepas dari perbandingan massa keduanya.

Mengapa tidak menggunakan jumlah nanogram vektor dan sisipan yang sama?

Fragmen DNA dengan panjang berbeda memiliki massa per molekul yang berbeda. Sisipan 1 kb memiliki bobot sekitar sepertiga dari vektor 3 kb untuk setiap molekul. Jumlah nanogram yang sama dari masing-masing fragmen tidak akan menghasilkan jumlah molekul yang sama, sehingga kalkulator menyesuaikan massa sisipan agar sesuai dengan rasio molar target.

Apa artinya jika volume total terlalu kecil?

Artinya, volume vektor dan sisipan saja sudah menghabiskan seluruh volume reaksi, sehingga tidak ada ruang untuk dapar atau ligase. Solusinya adalah meningkatkan volume total reaksi atau menggunakan stok DNA yang lebih pekat.

Dapatkah kalkulator ini digunakan untuk kloning Gibson Assembly atau Golden Gate?

Tidak. Metode tersebut menggunakan kimia reaksi yang berbeda dan biasanya menargetkan jumlah ekuimolar semua fragmen, bukan rasio sisipan:vektor yang tetap. Perhitungan volumenya berbeda dari kloning standar dengan ligase T4.

Berapa banyak DNA vektor yang biasanya digunakan?

50 ng adalah jumlah awal yang umum untuk reaksi ligasi standar. Laboratorium juga menggunakan jumlah dari 25 hingga 100 ng, yang disesuaikan dengan konsentrasi DNA dan skala reaksi.