Calcolatore di Diluizione Cellulare - Strumento Preciso per Diluizioni di Laboratorio

Calcolatore della diluizione cellulare

Un calcolatore della diluizione cellulare determina quanto sospensione cellulare e quanto diluente miscelare per raggiungere una concentrazione cellulare target in un volume finale scelto. Viene usato nella coltura cellulare, nella microbiologia e in altre attività di laboratorio in cui un campione deve essere portato a una concentrazione esatta prima dell'uso.

Che cosa significa diluire le cellule

La diluizione di una sospensione cellulare non modifica il numero di cellule che contiene. Modifica soltanto il volume in cui si trovano le cellule, riducendone così la concentrazione. Una sospensione conteggiata a 1.000.000 cellule per millilitro (cellule/mL) contiene ancora lo stesso numero totale di cellule dopo la diluizione. Quel numero è semplicemente distribuito in una quantità maggiore di liquido.

I laboratori diluiscono le cellule prima di molte operazioni di routine: suddividere una coltura in crescita in nuove beute, seminare un numero fisso di cellule in ciascun pozzetto di una piastra, congelare le cellule per conservarle oppure preparare un campione per un contacellule o un citometro a flusso.

Formula della diluizione cellulare

Il calcolo si basa su una regola. Il numero di cellule prelevate dalla sospensione di partenza, moltiplicato per la sua concentrazione, deve essere uguale al numero di cellule nel volume finale, moltiplicato per la concentrazione target:

C₁ × V₁ = C₂ × V₂

• C₁ — concentrazione iniziale (della sospensione madre), in cellule/mL
• V₁ — volume di sospensione madre da utilizzare, in mL
• C₂ — concentrazione target, in cellule/mL
• V₂ — volume finale totale necessario, in mL

Risolvendo l'equazione rispetto a V₁ si ottiene il volume di sospensione madre da pipettare:

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁

Il volume restante fino al volume finale è costituito dal diluente, solitamente terreno di coltura cellulare, soluzione salina tamponata con fosfati (PBS) o un altro tampone:

Volume di diluente = V₂ − V₁

La concentrazione target (C₂) non può mai essere superiore alla concentrazione della sospensione madre (C₁). La diluizione riduce soltanto la concentrazione. Per aumentarla, è necessario centrifugare le cellule e risospenderle in una quantità minore di liquido.

Come calcolare una diluizione cellulare

1. Contare la sospensione madre con un emocitometro o un contacellule automatico per ottenere C₁.
2. Annotare la concentrazione target, C₂, richiesta dal protocollo.
3. Stabilire il volume finale totale, V₂, necessario.
4. Calcolare V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁.
5. Calcolare il volume di diluente come V₂ − V₁.
6. Pipettare V₁ di sospensione madre in una provetta, quindi aggiungere il volume di diluente costituito da terreno o tampone.

Esempio svolto

Una sospensione madre è conteggiata a 1.000.000 cellule/mL. Un protocollo richiede 100.000 cellule/mL in un volume finale di 10 mL.

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁ = (100.000 × 10) ÷ 1.000.000 = 1.000.000 ÷ 1.000.000 = 1 mL

Volume di diluente = V₂ − V₁ = 10 − 1 = 9 mL

Prelevando 1 mL di sospensione madre e aggiungendo 9 mL di terreno si ottengono 10 mL di sospensione a 100.000 cellule/mL.

Un secondo esempio

Un saggio su una piastra a 96 pozzetti richiede 10.000 cellule per pozzetto in 200 microlitri (μL) di terreno per pozzetto. Ciò corrisponde a una concentrazione target di 50.000 cellule/mL, poiché 10.000 cellule divise per 0,2 mL equivalgono a 50.000 cellule/mL. La sospensione madre è conteggiata a 2.000.000 cellule/mL e sono necessari complessivamente 20 mL per coprire la piastra, lasciando un certo eccesso per compensare le perdite durante il pipettaggio.

V₁ = (50.000 × 20) ÷ 2.000.000 = 1.000.000 ÷ 2.000.000 = 0,5 mL

Volume di diluente = 20 − 0,5 = 19,5 mL

Miscelando 0,5 mL di sospensione madre con 19,5 mL di terreno si ottengono 20 mL a 50.000 cellule/mL, con una diluizione di 1 su 40.

Fonti di errore

La formula in sé è esatta. Gli errori derivano dai numeri inseriti.

• Errore di conteggio. Un conteggio cellulare errato porta direttamente a una diluizione errata. Contare tutti e quattro i quadrati agli angoli della griglia dell'emocitometro e calcolarne la media riduce questo rischio.
• Cellule aggregate. Al microscopio un aggregato di cellule appare come una sola cellula, ma in realtà ne contiene diverse, riducendo così la concentrazione apparente.
• Intervallo della pipetta. Una pipetta usata al di fuori del suo intervallo nominale di volume produce risultati imprecisi. Una pipetta da 1000 μL impostata per erogare 5 μL non è affidabile; è necessario usare una pipetta più piccola.
• Confusione tra unità. Mescolare cellule/mL e cellule/μL produce un errore mille volte maggiore o minore del dovuto.
• Cellule morte. Un conteggio cellulare grezzo include le cellule morte, a meno che non sia stato usato un colorante di vitalità, come il blu tripano. Ciò può sovrastimare il numero effettivo di cellule vive presenti.

Limiti di questo calcolatore

Il calcolatore rifiuta i numeri per i quali non può fornire un risultato utile:

• Ogni valore deve essere maggiore di zero.
• La concentrazione target non può essere superiore alla concentrazione iniziale.
• La concentrazione iniziale deve essere pari o inferiore a 1 trilione di cellule/mL (1 × 10¹²).
• Il volume di sospensione madre calcolato deve essere almeno 0,001 mL, cioè 1 microlitro. Un volume inferiore non può essere pipettato con accuratezza, quindi il calcolatore richiede numeri diversi. Di solito aumentare il volume totale risolve il problema.

I volumi sono visualizzati con due cifre decimali, o con tre quando il volume della sospensione madre è inferiore a 0,01 mL, in modo che un piccolo volume non appaia mai come 0,00 mL.

Domande frequenti

Qual è la formula per la diluizione cellulare?

C₁ × V₁ = C₂ × V₂, dove C₁ e C₂ sono le concentrazioni iniziale e target, mentre V₁ e V₂ sono rispettivamente il volume prelevato dalla sospensione madre e il volume finale totale.

La concentrazione target può essere superiore a quella iniziale?

No. La diluizione riduce soltanto la concentrazione. Per raggiungere una concentrazione maggiore è necessario centrifugare le cellule e risospenderle in un volume minore.

Quale liquido si deve usare per diluire le cellule?

Si usa un terreno di coltura completo quando le cellule devono rimanere vitali per ore o giorni, per esempio prima di seminarle in una piastra. Il PBS o una soluzione salina tamponata simile è adatto per diluizioni brevi, inferiori a circa 30 minuti, prima di sottoporre ulteriormente le cellule a trattamento. Si usa un terreno privo di siero quando le proteine del siero interferirebbero con un saggio successivo.

Questa formula funziona per batteri o lieviti?

Sì. C₁V₁ = C₂V₂ si applica a qualsiasi sospensione di particelle, compresi i batteri misurati in unità formanti colonie per millilitro (CFU/mL), i lieviti e le particelle virali misurate in unità formanti placche per millilitro (PFU/mL), purché si usino le stesse unità ai due membri dell'equazione.

Si devono contare le cellule morte nella diluizione?

Per seminare una coltura viva, si devono contare solo le cellule vitali. Se una sospensione è vitale per 80%, la sua concentrazione di cellule vitali è pari a 0,8 volte il conteggio cellulare totale e tale concentrazione deve essere usata come C₁.

Come si possono realizzare con accuratezza diluizioni molto elevate?

Le diluizioni elevate, come 1 su 1000, vengono generalmente eseguite come una serie di passaggi più piccoli, chiamati diluizioni seriali. Tre diluizioni successive di 1 su 10 raggiungono complessivamente 1 su 1000, mantenendo ogni passaggio di pipettaggio entro un intervallo di volume accurato.