Calcolatore della Concentrazione Proteica | A280 in mg/mL

Calcolatore della concentrazione proteica

Un calcolatore della concentrazione proteica converte una lettura di assorbanza della luce da uno spettrofotometro nella quantità di proteina disciolta in una soluzione. Il risultato è di solito espresso in milligrammi per millilitro (mg/mL) o in microgrammi per millilitro (μg/mL). Il calcolo si basa sulla legge di Lambert-Beer, una relazione della chimica che lega la quantità di luce assorbita da un campione alla quantità di sostanza che contiene.

Come si misura la concentrazione proteica

La maggior parte delle proteine assorbe fortemente la luce ultravioletta a una lunghezza d'onda di 280 nanometri (nm). Questo assorbimento deriva principalmente da due amminoacidi, il triptofano e la tirosina, presenti nella struttura della proteina. Uno spettrofotometro fa passare la luce attraverso il campione e misura quanta ne viene assorbita. Questa lettura si chiama assorbanza, o A280 quando è rilevata a 280 nm.

Misurare l'assorbanza a 280 nm è rapido e non distrugge il campione. Questo lo distingue dai metodi chimici come il saggio di Bradford o il saggio BCA, descritti più avanti. Il metodo funziona meglio su una proteina purificata in soluzione, con una lettura di assorbanza compresa tra circa 0,1 e 1,0. Le letture al di fuori di questo intervallo sono meno affidabili, quindi spesso è necessario diluire il campione prima della misura.

Formula della concentrazione proteica

Il calcolatore riarrangia la legge di Lambert-Beer per ricavare la concentrazione:

C = (A × DF) / (ε × l)

• C — concentrazione proteica, in mg/mL
• A — assorbanza a 280 nm (un numero puro, senza unità)
• DF — fattore di diluizione, cioè quante volte il campione originale è stato diluito prima di essere misurato
• ε — coefficiente di estinzione, una costante specifica della proteina, in L/(g·cm)
• l — cammino ottico, cioè la distanza percorsa dalla luce nel campione, in cm (di solito 1 cm in una cuvetta standard, un piccolo contenitore di vetro o di plastica usato nello spettrofotometro)

Per convertire il risultato in microgrammi per millilitro, moltiplicare il valore in mg/mL per 1.000. Per ottenere la massa totale di proteina nel campione, moltiplicare la concentrazione per il volume del campione in millilitri.

Esempio pratico

Un campione fornisce una lettura di assorbanza di 0,5 a 280 nm. Non è stato diluito, quindi il fattore di diluizione è 1, ed è stato misurato in una cuvetta standard da 1 cm. La proteina è l'albumina sierica bovina (BSA), che ha un coefficiente di estinzione di 0,667 L/(g·cm).

C = (0,5 × 1) / (0,667 × 1) ≈ 0,75 mg/mL

In un campione da 1 mL si ottengono circa 0,75 mg di proteina totale, ovvero 750 μg/mL.

Coefficienti di estinzione di proteine comuni

Ogni proteina assorbe la luce in modo diverso, perché ciascuna ha un numero diverso di residui di triptofano e tirosina. Il coefficiente di estinzione descrive questo comportamento per una proteina specifica a 280 nm, in unità di L/(g·cm). I valori di uso comune comprendono:

Un calcolatore può anche accettare un coefficiente di estinzione personalizzato per una proteina non presente in questo elenco. Per una proteina con sequenza amminoacidica nota, questo valore può essere stimato sommando l'assorbanza dei suoi residui di triptofano, tirosina e cistina, un metodo pubblicato da Gill e von Hippel nel 1989. ProtParam lo applica con i coefficienti misurati da Pace e colleghi nel 1995: ε₂₈₀ = (residui di triptofano × 5.500) + (residui di tirosina × 1.490) + (residui di cistina × 125). Questa formula fornisce un risultato in M⁻¹cm⁻¹, un'unità molare, che differisce dai valori basati sulla massa in L/(g·cm) riportati sopra. Strumenti gratuiti come ProtParam, ospitato dal server ExPASy, calcolano questo valore direttamente da una sequenza proteica.

Cammino ottico e fattore di diluizione

Il cammino ottico è la larghezza della cuvetta che contiene il campione, misurata in centimetri. Le cuvette standard sono larghe 1 cm. Gli spettrofotometri per microvolumi, che misurano campioni molto piccoli, possono usare un cammino molto più corto, per esempio 0,1 cm.

Il fattore di diluizione tiene conto di qualsiasi diluizione eseguita prima della misura. Se un campione concentrato darebbe un'assorbanza superiore a 1,0, di solito lo si diluisce prima con una soluzione tampone. Il fattore di diluizione è uguale al volume totale diluito diviso per il volume originale del campione. Per esempio, mescolando 10 μL di campione con 990 μL di tampone si ottiene un volume totale di 1.000 μL, cioè un fattore di diluizione di 100.

Altri modi per misurare la concentrazione proteica

L'assorbanza a 280 nm è uno dei diversi metodi comuni usati in laboratorio.

• Saggio di Bradford: usa un colorante che cambia colore quando si lega alla proteina. Funziona bene su campioni non purificati, ma il cambiamento di colore può variare tra proteine diverse.
• Saggio BCA: si basa su un cambiamento di colore provocato dai legami peptidici della proteina. È compatibile con molti detergenti, ma richiede più tempo di una lettura diretta dell'assorbanza.
• Metodo di Lowry: un metodo più datato, molto sensibile, ma che reagisce male con alcuni componenti comuni dei tamponi.

Ciascuno di questi tre metodi distrugge il campione. Una misura diretta dell'A280 no, quindi lo stesso campione può essere recuperato e riutilizzato.

Domande frequenti

Qual è l'intervallo di assorbanza ideale per questo metodo?

Tra 0,1 e 1,0. Sotto 0,1 la lettura è imprecisa. Sopra 1,0 la relazione tra assorbanza e concentrazione può non essere più lineare, quindi il campione va diluito prima.

Perché misurare a 280 nm invece che a 260 nm?

Gli acidi nucleici, come il DNA e l'RNA, assorbono fortemente a 260 nm. Le proteine assorbono di più a 280 nm per via del loro contenuto di triptofano e tirosina. Misurare a 280 nm riduce l'interferenza degli eventuali acidi nucleici presenti nel campione.

Come si ricava il coefficiente di estinzione di una proteina non elencata?

Per una proteina con sequenza nota, uno strumento come ProtParam lo calcola a partire dal numero di residui di triptofano, tirosina e cistina. Si può anche misurare direttamente, confrontando l'assorbanza del campione con quella di una soluzione a concentrazione nota.

Questo metodo funziona per una miscela di proteine?

Funziona meglio per una singola proteina purificata con un coefficiente di estinzione noto. Una miscela di proteine sconosciute, come un lisato cellulare, si misura di solito con il saggio di Bradford o BCA, poiché questi metodi forniscono una stima più coerente della proteina totale.

I detergenti possono interferire con la lettura?

Sì. Molti detergenti assorbono la luce vicino a 280 nm, il che può alterare il risultato. Usare un campione di bianco con la stessa concentrazione di detergente aiuta a eliminare questo assorbimento di fondo. Concentrazioni molto alte di detergente possono richiedere un saggio compatibile con i detergenti, come il BCA.

Riferimenti

1. SIB Swiss Institute of Bioinformatics, ExPASy. ProtParam documentation. Documentazione di ProtParam — coefficiente di estinzione a 280 nm in acqua da Ext(Tyr) = 1490, Ext(Trp) = 5500 e Ext(Cystine) = 125; metodo di Gill e von Hippel (1989), coefficienti di Pace et al. (1995).