Calcolatore della Concentrazione Proteica | A280 in mg/mL

Calcolatore della concentrazione proteica

Un calcolatore della concentrazione proteica converte una lettura dell'assorbanza luminosa ottenuta con uno spettrofotometro nella quantità di proteina disciolta in una soluzione. Il risultato è solitamente espresso in milligrammi per millilitro (mg/mL) o microgrammi per millilitro (μg/mL). Il calcolo si basa sulla legge di Beer-Lambert, una relazione chimica che collega la quantità di luce assorbita da un campione alla quantità di sostanza che contiene.

Come si misura la concentrazione delle proteine

La maggior parte delle proteine assorbe fortemente la luce ultravioletta a una lunghezza d'onda di 280 nanometri (nm). Questo assorbimento è dovuto soprattutto a due amminoacidi, il triptofano e la tirosina, presenti nella struttura della proteina. Uno spettrofotometro fa passare la luce attraverso il campione e misura quanta luce viene assorbita. Questa lettura si chiama assorbanza, o A280 quando viene effettuata a 280 nm.

La misurazione dell'assorbanza a 280 nm è rapida e non distrugge il campione. Questo la distingue dai metodi chimici come il saggio Bradford o il saggio BCA, descritti di seguito. Il metodo funziona meglio con una proteina purificata in soluzione, con una lettura dell'assorbanza compresa approssimativamente tra 0,1 e 1,0. Le letture al di fuori di questo intervallo sono meno affidabili, quindi spesso è necessario diluire il campione prima della misurazione.

Formula della concentrazione proteica

Il calcolatore riordina la legge di Beer-Lambert per risolvere la concentrazione:

C = (A × DF) / (ε × l)

• C — concentrazione della proteina, in mg/mL
• A — assorbanza a 280 nm (un numero puro, senza unità)
• DF — fattore di diluizione, il numero di volte in cui il campione originale è stato diluito prima della misurazione
• ε — coefficiente di estinzione, una costante specifica della proteina, in L/(g·cm)
• l — cammino ottico, la distanza percorsa dalla luce attraverso il campione, in cm (solitamente 1 cm in una cuvetta standard, un piccolo contenitore di vetro o plastica utilizzato nello spettrofotometro)

Per convertire il risultato in microgrammi per millilitro, moltiplicare il valore in mg/mL per 1.000. Per trovare la massa totale di proteina nel campione, moltiplicare la concentrazione per il volume del campione espresso in millilitri.

Esempio di calcolo

Un campione dà una lettura dell'assorbanza di 0,5 a 280 nm. Non è stato diluito, quindi il fattore di diluizione è 1, ed è stato misurato in una cuvetta standard da 1 cm. La proteina è l'albumina sierica bovina (BSA), che ha un coefficiente di estinzione di 0,667 L/(g·cm).

C = (0,5 × 1) / (0,667 × 1) ≈ 0,75 mg/mL

In un campione da 1 mL, ciò corrisponde a circa 0,75 mg di proteina totale, ovvero 750 μg/mL.

Coefficienti di estinzione delle proteine comuni

Ogni proteina assorbe la luce in modo diverso, perché contiene un numero diverso di residui di triptofano e tirosina. Il coefficiente di estinzione descrive questo comportamento per una specifica proteina a 280 nm, nelle unità L/(g·cm). Tra i valori utilizzati più spesso vi sono:

Un calcolatore può anche accettare un coefficiente di estinzione personalizzato per una proteina non presente nell'elenco. Per una proteina della quale è nota la sequenza amminoacidica, questo valore può essere stimato con una formula pubblicata da Gill e von Hippel nel 1989: ε₂₈₀ = (residui di triptofano × 5,500) + (residui di tirosina × 1,490) + (residui di cistina × 125). Questa formula restituisce un risultato in M⁻¹cm⁻¹, un'unità molare diversa dai valori basati sulla massa espressi in L/(g·cm) riportati sopra. Strumenti gratuiti come ProtParam, ospitato dal server ExPASy, calcolano direttamente questo valore a partire dalla sequenza di una proteina.

Cammino ottico e fattore di diluizione

Il cammino ottico è la larghezza della cuvetta che contiene il campione, misurata in centimetri. Le cuvette standard hanno una larghezza di 1 cm. Gli spettrofotometri a microvolume, che misurano campioni molto piccoli, possono utilizzare un cammino molto più breve, ad esempio 0,1 cm.

Il fattore di diluizione tiene conto di qualsiasi diluizione effettuata prima della misurazione. Se un campione concentrato producesse un'assorbanza superiore a 1,0, è comune diluirlo prima con un tampone. Il fattore di diluizione è uguale al volume totale diluito diviso per il volume del campione originale. Per esempio, mescolando 10 μL di campione con 990 μL di tampone si ottiene un volume totale di 1.000 μL e un fattore di diluizione pari a 100.

Altri metodi per misurare la concentrazione proteica

L'assorbanza a 280 nm è uno dei diversi metodi comunemente utilizzati in laboratorio.

• Saggio Bradford: utilizza un colorante che cambia colore quando si lega alle proteine. Funziona bene con campioni non purificati, ma il cambiamento di colore può variare tra proteine diverse.
• Saggio BCA: si basa su un cambiamento di colore causato dai legami peptidici della proteina. È compatibile con molti detergenti, ma richiede più tempo di una lettura diretta dell'assorbanza.
• Metodo di Lowry: un metodo più datato e molto sensibile, che però reagisce negativamente con alcuni componenti comuni dei tamponi.

Ognuno di questi tre metodi distrugge il campione. Una misurazione diretta A280 non lo fa, quindi lo stesso campione può essere recuperato e utilizzato nuovamente.

Domande frequenti

Qual è l'intervallo di assorbanza ideale per questo metodo?

Tra 0,1 e 1,0. Al di sotto di 0,1, la lettura è imprecisa. Al di sopra di 1,0, la relazione tra assorbanza e concentrazione potrebbe non essere più lineare, quindi il campione dovrebbe essere prima diluito.

Perché misurare a 280 nm invece che a 260 nm?

Gli acidi nucleici, come DNA e RNA, assorbono fortemente a 260 nm. Le proteine assorbono maggiormente a 280 nm a causa del loro contenuto di triptofano e tirosina. La misurazione a 280 nm riduce l'interferenza degli eventuali acidi nucleici presenti nel campione.

Come si trova il coefficiente di estinzione di una proteina non presente nell'elenco?

Per una proteina di cui è nota la sequenza, uno strumento come ProtParam lo calcola a partire dal numero di residui di triptofano, tirosina e cistina. Il coefficiente può anche essere misurato direttamente, confrontando l'assorbanza del campione con quella di una soluzione a concentrazione nota.

Questo metodo funziona per una miscela di proteine?

Funziona meglio per una singola proteina purificata con un coefficiente di estinzione noto. Una miscela di proteine sconosciute, come un lisato cellulare, viene solitamente analizzata con il saggio Bradford o BCA, poiché questi metodi forniscono una stima più uniforme della quantità totale di proteine.

I detergenti possono interferire con la lettura?

Sì. Molti detergenti assorbono la luce vicino a 280 nm, il che può alterare il risultato. L'utilizzo di un campione bianco contenente la stessa concentrazione di detergente aiuta a compensare l'assorbanza di fondo. Concentrazioni molto elevate di detergente possono richiedere invece un saggio compatibile con i detergenti, come il BCA.