Calcolatore di Efficienza qPCR: Strumento di Analisi della Curva Standard

Calcolatore dell’efficienza della qPCR

Un calcolatore dell’efficienza della qPCR stima quanto bene una reazione di PCR quantitativa (qPCR) copia la sequenza di DNA bersaglio a ogni ciclo di amplificazione. Utilizza i valori Ct (il numero di ciclo al quale il segnale fluorescente supera una soglia prestabilita) ottenuti da una serie di diluizioni per calcolare efficienza, pendenza, intercetta e R².

Che cos’è l’efficienza della qPCR?

La PCR quantitativa monitora la fluorescenza mentre una reazione copia una sequenza di DNA bersaglio, ciclo dopo ciclo. L’efficienza di amplificazione descrive quanto aumenta la quantità di DNA bersaglio a ogni ciclo. Con un’efficienza del 100%, la quantità di DNA bersaglio raddoppia a ogni ciclo.

Le reazioni reali raramente raggiungono esattamente il 100%. La maggior parte dei laboratori considera accettabile, per una quantificazione affidabile, un’efficienza compresa tra 90% e 110%. Un valore inferiore a 90% o superiore a 110% indica un possibile problema, come una progettazione inadeguata dei primer, inibitori della PCR trasferiti dall’estrazione del campione o errori di pipettaggio nella serie di diluizioni.

L’efficienza è particolarmente importante quando si confronta l’espressione genica tra campioni. Il metodo comune ΔΔCt per il calcolo della variazione relativa presuppone che ogni reazione abbia un’efficienza del 100%. Quando l’efficienza misurata differisce dal 100%, oppure quando un gene bersaglio e un gene di riferimento hanno efficienze diverse, i risultati della variazione relativa possono essere inaccurati.

Formula dell’efficienza della qPCR

L'efficienza si calcola a partire dalla pendenza della curva standard, una retta ottenuta riportando in grafico i valori Ct rispetto al logaritmo in base 10 (log10) della quantità di DNA di partenza in una serie di diluizioni.

E = 10^(-1/pendenza) - 1

E è l’efficienza, espressa come numero decimale (moltiplicare per 100 per ottenere la percentuale). La pendenza è quella della retta della curva standard. È negativa, perché il Ct aumenta quando diminuisce la quantità di DNA iniziale.

Una pendenza di -3,32 corrisponde a un’efficienza del 100%:

10^(-1/-3,32) - 1 = 10^0,301 - 1 ≈ 1,00

Il risultato è dovuto al fatto che una diluizione di 10 volte dovrebbe spostare il Ct di circa 3,32 cicli se la reazione raddoppia il DNA a ogni ciclo, poiché log2(10) è approssimativamente 3,32.

In pratica, una pendenza compresa tra -3,1 e -3,6 è considerata accettabile. Questo intervallo corrisponde a un’efficienza di circa il 90%–110%. Una pendenza più vicina a -3,1 produce un’efficienza calcolata maggiore; una pendenza più vicina a -3,6 ne produce una minore.

Come calcolare l’efficienza della qPCR: metodo della curva standard

Preparare una serie di diluizioni. Iniziare dal campione più concentrato e diluirlo di un fattore fisso, comunemente 10 volte, per ogni campione successivo. Eseguire la qPCR su ogni diluizione e registrare il relativo valore Ct.
Convertire ogni diluizione in un valore log10. Considerando il primo campione, quello più concentrato, come posizione 0, il campione numero i ha un log10 della quantità relativa pari a -i × log10 del fattore di diluizione.
Rappresentare il Ct (asse verticale) rispetto al valore log10 (asse orizzontale) per ogni diluizione ed eseguire una regressione lineare.
Ricavare la pendenza, l’intercetta e l’R² della retta di regressione.
Inserire la pendenza nella formula E = 10^(-1/pendenza) - 1 per ottenere l’efficienza.

Criteri di qualità della curva standard

R² di almeno 0,98. Misura quanto i punti si adattano a una retta. Un valore più basso indica spesso errori di pipettaggio o un’amplificazione non uniforme.
Pendenza compresa tra -3,1 e -3,6. Questo intervallo corrisponde a un'efficienza del 90-110%.
Almeno tre punti di diluizione. Cinque o sei punti producono una retta più affidabile e rendono più facile individuare un valore anomalo.
Il campione più concentrato dovrebbe fornire un Ct intorno a 15-20. Il campione più diluito dovrebbe rimanere al di sotto di Ct 35, poiché valori superiori si avvicinano al limite di rilevabilità.

Esempio pratico

Una serie di diluizioni di cinque punti, con diluizioni di 10 volte, fornisce questi valori Ct, dal campione più al meno concentrato: 15,0, 18,5, 22,0, 25,5, 29,0.

I valori log10 della quantità relativa sono 0, -1, -2, -3, -4, poiché ogni passaggio di diluizione aggiunge -log10(10), cioè -1. Il Ct aumenta di 3,5 cicli a ogni passaggio, quindi i punti si dispongono su una retta e la regressione lineare fornisce:

Pendenza: -3,5
Intercetta: 15,0
R²: 1,0

Efficienza: E = 10^(-1/-3,5) - 1 = 10^0,286 - 1 ≈ 0,931, ovvero circa il 93%.

Un’efficienza del 93% con R² = 1,0 soddisfa i criteri di qualità standard ed è adatta alla quantificazione dell’espressione genica.

Esempio di codice

Questa funzione JavaScript segue lo stesso metodo del calcolatore. L’indice di ogni valore Ct viene negato prima di calcolare il logaritmo, perché il primo campione, quello più concentrato, ha la quantità relativa maggiore e ogni campione successivo è più diluito.

1function qpcrEfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
2  // Sample 0 is most concentrated; each later sample is diluted further,
3  // so its log10(relative quantity) is negative.
4  const x = ctValues.map((_, i) => -i * Math.log10(dilutionFactor));
5  const n = ctValues.length;
6  let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0;
7  for (let i = 0; i < n; i++) {
8    sumX += x[i];
9    sumY += ctValues[i];
10    sumXY += x[i] * ctValues[i];
11    sumXX += x[i] * x[i];
12  }
13  const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
14  const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
15  const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
16  return { efficiency, slope, intercept };
17}
18
19qpcrEfficiency([15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0], 10);
20// => { efficiency: 93.07, slope: -3.5, intercept: 15 }
21

Perché l’efficienza è importante per l’espressione genica

I calcoli della variazione relativa, compreso il metodo ΔΔCt, presuppongono che ogni reazione raddoppi il proprio bersaglio a ogni ciclo. Quando un gene bersaglio e un gene di riferimento hanno efficienze misurate diverse, la formula ΔΔCt semplice introduce un errore. I ricercatori ricorrono spesso a un calcolo corretto per l'efficienza, come il metodo descritto da Michael Pfaffl nel 2001, quando le efficienze differiscono di più di circa cinque punti percentuali. Le linee guida MIQE, un insieme di standard di rendicontazione per la qPCR largamente citato e pubblicato nel 2009, raccomandano che gli studi riportino l'efficienza calcolata, la pendenza e R² insieme ai risultati della quantificazione.

Domande frequenti

Qual è una buona percentuale di efficienza della qPCR?

Un valore compreso tra il 90% e il 110% è generalmente accettato, con saggi ben ottimizzati che si attestano intorno al 95-105%. Una pendenza di -3,32 corrisponde esattamente al 100%.

Perché l’efficienza della mia qPCR è superiore al 110%?

Tra le cause comuni vi sono errori di pipettaggio nella serie di diluizioni, dimeri di primer, inibitori che influenzano in modo diverso i campioni concentrati e diluiti, oppure una soglia di fluorescenza impostata al di fuori della fase esponenziale dell’amplificazione. Una curva di melting con più di un picco può indicare la presenza di dimeri di primer.

Perché l’efficienza della mia qPCR è inferiore al 90%?

Tra le cause probabili vi sono una progettazione inadeguata dei primer, inibitori della PCR trasferiti dall’estrazione del campione o una temperatura di appaiamento non ottimale. Verificare la specificità dei primer ed eseguire un gradiente di temperatura può aiutare a individuare la causa.

Che cosa significa un valore R² basso?

R² misura quanto bene i valori Ct si adattano a una retta rispetto al logaritmo della diluizione. Un valore inferiore a 0,98 suggerisce imprecisioni nel pipettaggio, un campione inibito o un punto di diluizione vicino al limite di rilevabilità.

Di quanti punti di diluizione ha bisogno una curva standard?

Almeno tre, il numero minimo necessario per una regressione lineare. Cinque o sei punti forniscono una pendenza più affidabile e rendono più facile individuare i valori anomali.

L’efficienza può cambiare tra esperimenti?

Sì. Un nuovo lotto di reagenti, un nuovo lotto di primer, un tipo diverso di campione o uno strumento qPCR diverso possono modificare l’efficienza. Molti laboratori ricontrollano l’efficienza ogni pochi mesi o con ogni nuovo lotto di reagenti.

Riferimenti

Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. How good is a PCR efficiency estimate: Recommendations for precise and robust qPCR efficiency assessments. Biomolecular Detection and Quantification, 2015. Svec et al. 2015 (PMC) — E = 10^(−1/pendenza) − 1, e una pendenza di circa −3,3 per una serie con diluizioni di 10 volte a un'efficienza del 100%.
Pfaffl MW. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research, 2001. Pfaffl 2001 (PMC) — il modello di quantificazione relativa corretto per l'efficienza; E = 10^(−1/pendenza) di Pfaffl è il fattore di amplificazione per ciclo, pari a 1 più l'efficienza usata in questo articolo.

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