Calcolatore di Concentrazione del DNA | Convertitore A260 in ng/μL

Calcolatore della concentrazione del DNA

Un calcolatore della concentrazione del DNA converte una lettura dell’assorbanza UV a 260 nanometri, denominata A260, nella concentrazione di DNA espressa in nanogrammi per microlitro (ng/µL). Riporta anche la quantità totale di DNA presente in un campione, in microgrammi (µg).

Che cos’è l’assorbanza A260?

A260 è la quantità di luce ultravioletta assorbita da una soluzione a una lunghezza d’onda di 260 nanometri. Il DNA assorbe la luce UV in modo massimo vicino a questa lunghezza d’onda a causa delle sue basi nucleotidiche. Uno spettrofotometro misura A260 dopo una lettura del bianco, eseguita con lo stesso tampone del campione, che rimuove l’assorbanza di fondo. Maggiore è la quantità di DNA nella soluzione, maggiore è la lettura A260.

Formula della concentrazione del DNA

Il DNA a doppio filamento assorbe la luce UV in proporzione alla propria concentrazione, una relazione nota come legge di Lambert-Beer. Con un cammino ottico standard di 1 centimetro, una soluzione con una lettura A260 di 1,0 contiene circa 50 ng/µL di DNA a doppio filamento. Questo valore, il fattore di conversione di 50 per il DNA, trasforma qualsiasi lettura A260 in una concentrazione:

Concentrazione del DNA (ng/µL) = A260 × 50 × fattore di diluizione

Il fattore di diluizione tiene conto di qualsiasi diluizione effettuata prima della misurazione del campione. Un campione misurato senza diluizione ha un fattore di diluizione pari a 1.

Come calcolare la resa totale di DNA

Una volta nota la concentrazione, la massa totale di DNA nel campione può essere ricavata dal suo volume:

DNA totale (µg) = concentrazione (ng/µL) × volume (µL) ÷ 1000

Come calcolare la concentrazione del DNA: procedura

1. Miscelare accuratamente il campione prima della misurazione. Il DNA può aderire alle pareti della provetta o depositarsi in modo non uniforme.
2. Diluire il campione se è molto concentrato, in modo da ottenere una lettura A260 compresa tra 0,1 e 1,0. Le letture dello spettrofotometro sono meno affidabili al di fuori di questo intervallo.
3. Azzerare lo spettrofotometro con lo stesso tampone usato per la diluizione, quindi misurare il campione a 260 nm.
4. Inserire nel calcolatore la lettura A260, il volume del campione e il fattore di diluizione per ottenere la concentrazione e la resa totale.

Esempi pratici

Esempio 1: campione non diluito

Una lettura A260 di 0,5, nessuna diluizione (fattore di diluizione 1) e un volume del campione di 100 µL.

• Concentrazione = 0,5 × 50 × 1 = 25 ng/µL
• DNA totale = 25 × 100 ÷ 1000 = 2,5 µg

Esempio 2: campione diluito

Un campione da 50 µL è stato diluito 10 volte prima della misurazione, con una lettura A260 di 0,75.

• Concentrazione = 0,75 × 50 × 10 = 375 ng/µL
• DNA totale = 375 × 50 ÷ 1000 = 18,75 µg

Calcolo del fattore di diluizione

Fattore di diluizione = volume totale dopo la diluizione ÷ volume del campione originale.

L’aggiunta di 5 µL di soluzione di DNA a 45 µL di tampone porta a un volume totale di 50 µL, quindi il fattore di diluizione è 50 ÷ 5 = 10. Un campione non diluito ha un fattore di diluizione pari a 1.

Intervalli tipici della concentrazione del DNA

La concentrazione dipende dal tipo di campione e dal metodo di estrazione. Un risultato molto al di fuori dell'intervallo atteso per un dato metodo può indicare un problema nell'estrazione o nella misurazione stessa.

Limiti della misurazione dell’assorbanza UV

La misurazione di A260 è rapida, ma non è il metodo più sensibile o specifico per il DNA. Le proteine, l’RNA e alcuni componenti del tampone assorbono anch’essi la luce vicino a 260 nm e possono aumentare la lettura. Per verificare la presenza di contaminazione proteica, spesso si controlla il rapporto A260/A280 insieme alla concentrazione; un rapporto vicino a 1,8 indica generalmente un campione di DNA puro. I metodi basati su coloranti fluorescenti, come i saggi Qubit, si legano solo al DNA a doppio filamento e forniscono una lettura più accurata per i campioni diluiti o impuri, ma richiedono reagenti aggiuntivi e un fluorimetro.

Domande frequenti

Come si calcola la concentrazione del DNA a partire da A260?

Moltiplicare la lettura A260 per 50, il fattore di conversione standard per il DNA a doppio filamento, quindi moltiplicare per il fattore di diluizione. Se il campione non è stato diluito, usare un fattore di diluizione pari a 1.

Qual è un buon rapporto A260/A280?

Un rapporto vicino a 1,8 indica generalmente un campione di DNA puro. Un rapporto più basso suggerisce una contaminazione proteica. Un rapporto superiore a 2,0 può indicare una contaminazione da RNA.

Si può usare questo calcolatore per l’RNA?

Non direttamente, perché per l’RNA si usa un fattore di conversione di 40 ng per microlitro invece di 50. Per stimare la concentrazione dell’RNA, moltiplicare il risultato del calcolatore per 0,8 (40 ÷ 50), oppure usare direttamente A260 × 40 × fattore di diluizione.

Perché la lettura A260 dovrebbe essere compresa tra 0,1 e 1,0?

L’assorbanza rimane approssimativamente proporzionale alla concentrazione, come descritto dalla legge di Beer-Lambert, soprattutto entro questo intervallo. Al di fuori di esso, le letture diventano meno affidabili; pertanto, un campione troppo concentrato o troppo diluito deve essere diluito o concentrato prima di una nuova misurazione.

Qual è la differenza tra concentrazione e purezza?

La concentrazione misura la quantità di DNA presente, in ng/µL. La purezza misura quanto è pulito il campione, valutandola principalmente attraverso rapporti di assorbanza come A260/A280. Un campione può avere una concentrazione elevata e rimanere impuro, oppure avere una concentrazione bassa ed essere molto puro.

Come si convertono ng/µL in µg/mL?

Le due unità sono numericamente equivalenti. 1 ng per microlitro equivale a 1 µg per millilitro, perché sia l’unità di massa sia quella di volume variano di un fattore 1000.

Riferimenti

1. Desjardins, P., & Conklin, D. (2010). NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids. Journal of Visualized Experiments. testo completo su PubMed Central — costanti di concentrazione di 50 per il DNA e 40 per l'RNA; rapporto A260/A280 di circa 1,8 per il DNA puro; rapporti più bassi indicano la presenza di proteine o altri contaminanti.
2. Massachusetts Institute of Technology, OpenCourseWare. 7.13 Experimental Microbial Genetics: UV spectrophotometric measurement of DNA concentration and purity. protocollo di spettrofotometria del MIT OCW — per una misurazione accurata il valore A260 deve essere compreso tra 0,1 e 1.