Calcolatore di Solubilità Proteica - Strumento Gratuito per pH e Temperatura

Un calcolatore della solubilità delle proteine stima la concentrazione massima di una proteina che rimane disciolta in un solvente a un determinato pH, temperatura e forza ionica. Converte i concetti fondamentali della chimica in un unico valore, espresso in milligrammi di proteina per millilitro di solvente.

La solubilità delle proteine è importante in biochimica, nella formulazione dei farmaci e nelle scienze alimentari. Una proteina che non rimane disciolta forma aggregati o precipitati, che possono compromettere un esperimento o rendere impossibile iniettare un farmaco.

Come calcolare la solubilità delle proteine

La solubilità dipende da cinque fattori: il punto isoelettrico della proteina (il pH al quale la sua carica netta è pari a zero), il suo punto di fusione (la temperatura alla quale inizia a perdere la struttura), la costante dielettrica del solvente (una misura della sua capacità di separare le particelle cariche), il pH della soluzione e la forza ionica (una misura della quantità di sale disciolto presente).

Il calcolatore parte dalla solubilità nota di ciascuna proteina in acqua in condizioni di riferimento prestabilite: 25 °C, pH 7,0 e una forza ionica di 0,15 M (approssimativamente il livello di sali nel sangue). Moltiplica quindi quel valore di riferimento per quattro rapporti, uno per ciascuna condizione che è cambiata.

Formula della solubilità delle proteine

$S = S_{ref} \times \frac{f_{pH}(pH)}{f_{pH}(7.0)} \times \frac{f_{ionic}(I)}{f_{ionic}(0.15)} \times \frac{f_{temp}(T)}{f_{temp}(25)} \times f_{solvent}(\varepsilon)$

• $S_{ref}$ è la solubilità nota della proteina in acqua nelle condizioni di riferimento, espressa in mg/mL.
• $f_{pH}(pH) = 1 + 9\left(1 - e^{-|pH - pI|}\right)$, dove $pI$ è il punto isoelettrico della proteina. La solubilità è minima al punto isoelettrico e aumenta quando il pH se ne allontana, stabilizzandosi entro un paio di unità di pH.
• $f_{ionic}(I) = 10^{\left(\frac{0.8\sqrt{I}}{1 + 1.5\sqrt{I}} - I\right)}$, dove $I$ è la forza ionica in moli per litro. A basse concentrazioni di sale, questo termine aumenta leggermente la solubilità («salting in»). A concentrazioni elevate di sale, la riduce («salting out»).
• $f_{temp}(T) = e^{0.01(T-25)} \times \dfrac{1}{1 + e^{(T - T_m)/3}}$, dove $T_m$ è il punto di fusione della proteina in °C. La solubilità aumenta gradualmente con la temperatura, poi diminuisce bruscamente quando la temperatura si avvicina a $T_m$ e la proteina inizia a perdere la struttura.
• $f_{solvent}(\varepsilon) = 10^{-2000\left(\frac{1}{\varepsilon^2} - \frac{1}{78.4^2}\right)}$, dove $\varepsilon$ è la costante dielettrica del solvente. L'acqua ha una costante dielettrica pari a 78,4, quindi in acqua questo termine è uguale a 1. I solventi che separano le cariche in modo meno efficace dell'acqua, come l'etanolo, riducono la solubilità.

Valori di riferimento utilizzati dal calcolatore

Categorie di solubilità

Esempio: albumina in tampone fosfato

Determinare la solubilità dell'albumina in tampone fosfato a 25 °C, pH 7,4 e una forza ionica di 0,15 M.

I valori di riferimento dell'albumina sono $pI = 4.7$, $S_{ref} = 500$ mg/mL e $T_m = 63°C$. Il tampone fosfato ha una costante dielettrica di 76,0.

1. Termine del pH: $f_{pH}(7.4) = 1 + 9(1 - e^{-2.7}) = 9.3952$. $f_{pH}(7.0) = 1 + 9(1 - e^{-2.3}) = 9.0977$. Rapporto: $9.3952 / 9.0977 = 1.0327$.
2. Termine ionico: la forza ionica (0,15 M) è uguale al valore di riferimento, quindi il rapporto è 1.
3. Termine della temperatura: la temperatura (25 °C) è uguale al valore di riferimento, quindi il rapporto è 1.
4. Termine del solvente: $f_{solvent}(76.0) = 10^{-2000(1/76.0^2 - 1/78.4^2)} = 0.9531$.

$S = 500 \times 1.0327 \times 1 \times 1 \times 0.9531 \approx 492.12\text{ mg/mL}$

Il calcolatore restituisce 492,12 mg/mL, un valore che rientra nella categoria «altamente solubile».

Esempio: lisozima in glicerolo a bassa temperatura

Determinare la solubilità del lisozima in una soluzione di glicerolo a 4 °C, pH 5,0 e una forza ionica di 0,1 M. Sono condizioni simili a quelle della conservazione a freddo di un enzima.

I valori di riferimento del lisozima sono $pI = 11.35$, $S_{ref} = 250$ mg/mL e $T_m = 72°C$. Il glicerolo ha una costante dielettrica di 42,5.

1. Termine del pH: il passaggio dal pH 7,0 al pH 5,0 (entrambi molto inferiori al pI di 11,35) modifica solo leggermente il termine del pH. Rapporto: $9.9843 / 9.8838 = 1.0102$.
2. Termine ionico: la riduzione della forza ionica da 0,15 M a 0,1 M aumenta leggermente la solubilità attraverso l'effetto salting in. Rapporto: $1.1793 / 1.1117 = 1.0607$.
3. Termine della temperatura: il raffreddamento da 25 °C a 4 °C, ben al di sotto del punto di fusione, riduce il termine. Rapporto: 0,8106 USD$.
4. Termine del solvente: $f_{solvent}(42.5) = 10^{-2000(1/42.5^2 - 1/78.4^2)} = 0.1652$.

$S = 250 \times 1.0102 \times 1.0607 \times 0.8106 \times 0.1652 \approx 35.88\text{ mg/mL}$

Il calcolatore restituisce 35,88 mg/mL, un valore che rientra nella categoria «solubile». È la bassa costante dielettrica del glicerolo, non la bassa temperatura, a ridurre il risultato rispetto al valore di riferimento.

Come usare il calcolatore della solubilità delle proteine

1. Scegliere una proteina dall'elenco: albumina, insulina, lisozima, emoglobina, mioglobina, collagene, caseina o fibrinogeno.
2. Scegliere un solvente: acqua, tampone fosfato, tampone Tris, glicerolo, DMSO, metanolo, etanolo o acetone.
3. Inserire la temperatura in °C (da 0 a 100), il pH (da 0 a 14) e la forza ionica in molare (da 0 a 2).
4. Leggere la solubilità calcolata in mg/mL e la relativa categoria. Una barra sotto il risultato mostra il valore su una scala da 0 a 100 mg/mL e si riempie completamente a 100 mg/mL o oltre.

Fattori che influenzano la solubilità delle proteine

pH e punto isoelettrico. Ogni proteina ha un punto isoelettrico, cioè il pH al quale la sua superficie non presenta alcuna carica elettrica netta. A quel pH, le molecole proteiche non si respingono tra loro, quindi si aggregano e precipitano più facilmente dalla soluzione. Allontanando il pH dal punto isoelettrico, in una direzione o nell'altra, si conferisce alla proteina una carica netta. Le molecole cariche si respingono, rimanendo separate e disciolte.

Forza ionica. Gli ioni dei sali disciolti circondano i gruppi carichi sulla superficie della proteina. A concentrazioni basse o moderate, questi ioni schermano le cariche che altrimenti attirerebbero tra loro due molecole proteiche, aumentando la solubilità. Questo fenomeno è chiamato salting in. A concentrazioni elevate di sale, gli ioni competono con la proteina per le molecole d'acqua, rimuovendo lo strato d'acqua che mantiene la proteina disciolta. Questo fenomeno è chiamato salting out ed è alla base di un comune metodo di purificazione che utilizza il solfato di ammonio per far precipitare le proteine da una miscela.

Temperatura. Il riscaldamento di una soluzione generalmente aumenta la solubilità, fino a un certo punto. Quando la temperatura si avvicina al punto di fusione di una proteina, questa inizia a perdere la propria struttura. Il processo espone le sezioni idrofobiche (che respingono l'acqua) della proteina, normalmente nascoste all'interno della sua struttura ripiegata. Le sezioni esposte aderiscono tra loro, provocando l'aggregazione; perciò la solubilità diminuisce bruscamente vicino e al di sopra del punto di fusione.

Solvente. La costante dielettrica di un solvente misura l'efficacia con cui indebolisce l'attrazione elettrica tra particelle cariche. L'acqua ha una costante dielettrica elevata e separa bene le cariche; per questo la maggior parte delle proteine si dissolve meglio in acqua che in solventi organici come etanolo o acetone. I solventi con una costante dielettrica bassa permettono alle cariche opposte su molecole proteiche diverse di attrarsi più fortemente, favorendo l'aggregazione.

Limitazioni

Il calcolatore utilizza un modello semplificato basato su un piccolo insieme di proteine di riferimento e solventi standard. Non tiene conto della purezza della proteina, di additivi come detergenti o stabilizzanti, né di componenti insoliti dei tamponi. I risultati sono stime utili per pianificare gli esperimenti, non sostituiscono la misurazione diretta della solubilità in laboratorio.

Domande frequenti

Che cos'è la solubilità delle proteine? La solubilità delle proteine è la concentrazione massima di una proteina che rimane completamente disciolta in un solvente, senza formare aggregati o precipitati visibili.

Perché una proteina è meno solubile al punto isoelettrico? Al punto isoelettrico, la proteina non presenta alcuna carica elettrica netta, quindi le molecole proteiche non si respingono più elettricamente. In assenza di questa repulsione, è più probabile che aderiscano tra loro e precipitino dalla soluzione.

Qual è la differenza tra salting in e salting out? Il salting in si verifica a basse concentrazioni di sale, quando gli ioni disciolti schermano reciprocamente i gruppi carichi della proteina e aumentano la solubilità. Il salting out si verifica ad alte concentrazioni di sale, quando gli ioni sottraggono acqua alla superficie della proteina e riducono la solubilità.

Una temperatura più elevata aumenta sempre la solubilità? No. La solubilità tende ad aumentare con la temperatura solo fino a un certo punto. Quando la temperatura si avvicina al punto di fusione di una proteina, questa inizia a perdere la struttura, causando generalmente aggregazione e una forte diminuzione della solubilità.

Perché le proteine si sciolgono meno in etanolo o acetone che in acqua? L'acqua ha una costante dielettrica elevata, cioè indebolisce molto efficacemente l'attrazione elettrica tra le parti cariche delle molecole proteiche. Etanolo e acetone hanno costanti dielettriche inferiori, quindi i gruppi carichi su molecole proteiche diverse si attraggono più fortemente in questi solventi, rendendo più probabile l'aggregazione.

Quanto è preciso questo calcolatore? Fornisce una stima basata su un modello fisico e su un piccolo insieme di proteine e solventi di riferimento. È utile per restringere le condizioni da sottoporre a verifica, ma la misurazione sperimentale rimane l'unico modo per confermare la solubilità di uno specifico campione proteico.

Approfondimenti

• Arakawa, T., & Timasheff, S. N. (1984). Mechanism of protein salting in and salting out by divalent cation salts. Biochemistry, 23(25), 5912–5923.
• Trevino, S. R., Scholtz, J. M., & Pace, C. N. (2008). Measuring and increasing protein solubility. Journal of Pharmaceutical Sciences, 97(10), 4155–4166.
• Cohn, E. J., & Edsall, J. T. (1943). Proteins, Amino Acids and Peptides as Ions and Dipolar Ions. Reinhold Publishing.