Calcolatore di Ligazione del DNA - Calcola i Rapporti Inserzione:Vettore per la Clonazione Molecolare

La ligazione del DNA è la fase del clonaggio molecolare in cui un frammento di inserto viene unito a un vettore plasmidico dalla DNA ligasi T4. Un calcolatore per la ligazione del DNA determina quanti microlitri di DNA inserto e di DNA vettore miscelare affinché la reazione raggiunga un determinato rapporto molare tra inserto e vettore.

Cosa fa il calcolatore

Il calcolatore utilizza sei input: concentrazione del vettore, lunghezza del vettore, concentrazione dell'inserto, lunghezza dell'inserto, rapporto molare obiettivo tra inserto e vettore e volume totale della reazione. Permette inoltre di impostare la quantità di DNA vettore da utilizzare, che per impostazione predefinita è di 50 nanogrammi (ng). Da questi valori calcola il volume di vettore da pipettare, il volume di inserto da pipettare e la quantità di tampone o acqua da aggiungere per raggiungere il volume totale della reazione.

La concentrazione si misura in nanogrammi per microlitro (ng/μL), generalmente rilevata con uno strumento Nanodrop o Qubit. La lunghezza si misura in paia di basi (bp). Un kilobase (kb) equivale a 1000 paia di basi. Il rapporto molare indica quante molecole di inserto devono essere presenti per ogni molecola di vettore. Non è un rapporto tra masse.

Perché si usa il rapporto molare e non la massa

Masse uguali di DNA non contengono numeri uguali di molecole. Un inserto corto pesa meno di un vettore lungo con lo stesso numero di molecole. Miscelare quantità uguali in nanogrammi di un inserto corto e di un vettore lungo lascerebbe un numero insufficiente di molecole di inserto rispetto alle molecole di vettore. Il calcolatore scala la massa dell'inserto in base al rapporto tra le lunghezze dei frammenti, così la miscela finale contiene il numero previsto di molecole di inserto per ogni molecola di vettore.

Formula della ligazione del DNA

La quantità di DNA inserto necessaria, espressa in nanogrammi, è:

$m_i = m_v \times \frac{k_i}{k_v} \times R$

dove $m_i$ è la quantità di inserto in nanogrammi, $m_v$ la quantità di vettore in nanogrammi, $k_i$ la lunghezza dell'inserto in kilobasi, $k_v$ la lunghezza del vettore in kilobasi e R il rapporto molare obiettivo tra inserto e vettore.

Una volta nota questa quantità, il calcolatore converte ciascuna quantità in un volume pipettabile:

$V_v = \frac{m_v}{c_v}$

$V_i = \frac{m_i}{c_i}$

$V_b = V_t - V_v - V_i$

dove $V_v$ e $V_i$ sono rispettivamente i volumi del vettore e dell'inserto in microlitri, $c_v$ e $c_i$ le concentrazioni del vettore e dell'inserto in nanogrammi per microlitro, $V_b$ il volume del tampone e $V_t$ il volume totale della reazione.

Se i volumi del vettore e dell'inserto insieme superano il volume totale della reazione, non rimane spazio per il tampone, la ligasi o l'acqua. In tal caso il calcolatore segnala che il volume totale è troppo piccolo, invece di mostrare una quantità negativa di tampone.

Esempio di calcolo

Un ricercatore sta clonando un frammento genico di 1 kb in un vettore plasmidico di 3 kb. Il piano prevede di utilizzare 50 ng di DNA vettore con un rapporto molare inserto:vettore di 3:1, in una reazione di 20 μL.

Input:

• Concentrazione del vettore: 50 ng/μL
• Lunghezza del vettore: 3000 bp (3 kb)
• Concentrazione dell'inserto: 25 ng/μL
• Lunghezza dell'inserto: 1000 bp (1 kb)
• Rapporto molare: 3
• Volume totale: 20 μL
• Quantità di vettore: 50 ng

Passaggio 1: quantità di inserto

ng di inserto = 50 × (1 ÷ 3) × 3 = 50 ng

Passaggio 2: volumi

Volume del vettore = 50 ng ÷ 50 ng/μL = 1 μL

Volume dell'inserto = 50 ng ÷ 25 ng/μL = 2 μL

Volume di tampone = 20 − 1 − 2 = 17 μL

La reazione è composta da 1 μL di vettore, 2 μL di inserto e 17 μL di tampone o acqua, dove vengono aggiunti anche la ligasi e il relativo tampone di reazione. Questa miscela fornisce tre molecole di inserto per ogni molecola di vettore.

Rapporti molari tipici per la ligazione

La maggior parte dei clonaggi standard con estremità adesive sporgenti utilizza un rapporto inserto:vettore pari a 3:1. Le ligazioni che uniscono estremità smusse sono meno efficienti, quindi è comune un rapporto più alto, ad esempio 5:1. Gli inserti molto grandi a volte funzionano meglio con un rapporto più basso, vicino a 1:1, poiché i frammenti grandi apportano già molte paia di basi per molecola.

Domande frequenti

Che cos'è la ligazione del DNA?

La ligazione del DNA è l'unione di due frammenti di DNA, generalmente un vettore plasmidico e un inserto, in un'unica molecola continua. La DNA ligasi T4 sigilla il collegamento tra le estremità dei frammenti.

Che cosa significa il rapporto molare inserto:vettore?

È il numero di molecole di DNA inserto presenti per ogni molecola di vettore nella reazione. Un rapporto 3:1 significa tre molecole di inserto per ogni molecola di vettore, indipendentemente dal confronto tra le loro masse.

Perché non usare quantità uguali in nanogrammi di vettore e inserto?

Frammenti di DNA di lunghezza diversa hanno masse diverse per molecola. Un inserto di 1 kb pesa circa un terzo rispetto a un vettore di 3 kb, a parità di numero di molecole. Quantità uguali in nanogrammi non fornirebbero numeri uguali di molecole, quindi il calcolatore adatta la massa dell'inserto per raggiungere il rapporto molare obiettivo.

Che cosa significa se il volume totale è troppo piccolo?

Significa che i soli volumi del vettore e dell'inserto utilizzano già tutto il volume della reazione, senza lasciare spazio per il tampone o la ligasi. La soluzione consiste nell'aumentare il volume totale della reazione o nell'utilizzare soluzioni madri di DNA più concentrate.

Questo calcolatore può essere utilizzato per il clonaggio Gibson Assembly o Golden Gate?

No. Questi metodi utilizzano una chimica di reazione diversa e in genere mirano a quantità equimolari di tutti i frammenti, anziché a un rapporto inserto:vettore fisso. I calcoli dei volumi differiscono da quelli del clonaggio standard con ligasi T4.

Quanta quantità di DNA vettore viene utilizzata normalmente?

50 ng è una quantità iniziale comune per una reazione di ligazione standard. I laboratori utilizzano anche quantità comprese tra 25 e 100 ng, adattate alla concentrazione del DNA e alla scala della reazione.