DNAアニーリング温度計算ツール | 無料PCR Tm計算ツール

DNAアニーリング温度計算機とは何ですか？

DNAアニーリング温度計算機は、配列からDNAプライマーの融解温度（Tm）を推定します。Tmは、プライマー分子の半分が標的鎖に結合し、残りの半分が結合していない温度です。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）では、この値を基に、プライマーをDNA鋳型に結合させる温度を設定します。

PCRでアニーリング温度が重要な理由

PCRでは、加熱と冷却を繰り返すサイクルによって、DNAの標的領域を複製します。各サイクルには3つの段階があります。まず、約95 °Cに加熱して二本鎖の鋳型を分離します。この段階を変性と呼びます。次に、反応液を通常は50 °Cから65 °Cのアニーリング温度まで冷却し、短いプライマーが一本鎖上の相補的な配列に結合できるようにします。第三に、温度を約72 °Cまで上げ、DNAポリメラーゼという酵素がプライマーを伸長して新しいDNA鎖を作ります。

アニーリング温度が低すぎると、プライマーが部分的にしか一致しない配列にも結合し、不要なDNA断片が余分に生成されます。高すぎると、プライマーが鋳型と安定した結合を形成できず、DNAはほとんど、またはまったく複製されません。PCR反応がうまくいかないとき、研究者が最初に調整する設定の一つがアニーリング温度です。

GC含量がTmに及ぼす影響

プライマーは水素結合によって標的と対合します。グアニン-シトシン（G-C）対は3本の水素結合を形成します。アデニン-チミン（A-T）対は2本です。G塩基とC塩基が多いプライマーは、引き離すためにより多くの熱を必要とするため、同じ長さでA塩基とT塩基が多いプライマーよりTmが高くなります。GC含量は通常、割合で表し、G塩基とC塩基の数を配列全体の長さで割り、100を掛けて求めます。

DNAアニーリング温度の計算式

この計算機は、プライマーの長さに応じて2種類の計算式のいずれかを適用します。

14ヌクレオチド以上のプライマーには、Marmur-DotyのGC含量計算式を使用します。

$Tm = 64.9 + 41 \times \frac{(N_{GC} - 16.4)}{N}$

ここでN_GCは、割合ではなく直接数えた、プライマー中のG塩基とC塩基の数です。Nは塩基の総数です。

14ヌクレオチド未満のプライマーには、Wallace則を使用します。

$Tm = 2 \times (A + T) + 4 \times (G + C)$

A、T、G、Cは、それぞれプライマー中の各塩基の数を表します。

どちらの式も、50ナノモルのプライマー、50ミリモルのNa+、pH7.0という標準条件を前提としており、両者を切り替える14塩基の境目も同じ慣例に従っています。

計算例

19塩基のプライマーATGCTAGCTAGCTGCTAGCを例に取ります。その長さは19で、14以上であるため、計算機はMarmur-Dotyの計算式を使用します。

• 長さ（N）= 19
• Gの数=5、Cの数=5、したがってN_GC=10
• GC含量=10 / 19 × 100 ≈ 52.6%
• Tm = 64.9 + 41 × (10 − 16.4) / 19
• Tm = 64.9 + 41 × (−6.4) / 19
• Tm = 64.9 − 13.8
• Tm ≈ 51.1 °C

この計算式では、GCの割合52.6ではなくGCの数10を使用します。誤って割合を使うと、Tmは143 °C付近となりますが、50 °Cから95 °Cの範囲で実施するPCR反応の値としては現実的ではありません。

この計算機の使い方

プライマー配列を、A、T、G、Cの文字だけを使って入力または貼り付けます。計算機には、配列の長さ、GC含量（百分率）、計算されたアニーリング温度が表示されます。結果は、実験ノートやプロトコルのためにコピーできます。

PCRのアニーリング温度の選び方

Tmは計算による推定値であり、実際に機能する温度が保証されるわけではありません。多くのPCRプロトコルでは、計算されたTmより数度低い温度から実際のアニーリング段階を開始し、ゲルで確認した結果に基づいて調整します。プライマー対では、通常、2本のプライマーのTmのうち低い方を開始点にします。グラジエントPCRは、複数の反応を一度にさまざまな温度範囲で実施する方法で、試験によって最適温度を見つける一般的な手段です。

Tmを推定するその他の方法

ここで使用するMarmur-Doty式とWallace則は、塩基組成だけに基づく迅速な近似です。ほかにも次の方法があります。

• 最近接塩基対熱力学は、隣り合う塩基の組ごとに安定性がどう変わるかを考慮します。広く使われているプライマー設計ツールの作者たちは、これを8から40塩基のオリゴヌクレオチドに適した方法として紹介しています。
• 塩濃度補正式は、反応緩衝液中のNa+またはK+イオン濃度に対する補正を加えます。塩濃度が高いほどDNA二重鎖が安定し、Tmが上昇するためです。

同じプライマーでも、異なる計算式を使用するため、計算機によって報告されるTmが異なることがあります。PCRを実施して結果を確認することが、最終的な判定になります。

よくある質問

DNAアニーリング温度とは何ですか？

PCR中に、DNAプライマーが鋳型鎖上の相補的な配列に結合する温度です。実験室では通常、プライマーの計算上の融解温度（Tm）より数度低く設定します。

プライマーのTmはどのように計算しますか？

14塩基以上のプライマーでは、Tm = 64.9 + 41 ×（GCの数 − 16.4）/長さです。14塩基未満のプライマーでは、Tm = 2 ×（A+Tの数）+ 4 ×（G+Cの数）です。

GC含量がTmを上昇させるのはなぜですか？

G-C塩基対は、A-T塩基対の2本に対して3本の水素結合を形成します。G塩基とC塩基の割合が高いプライマーは、標的から分離するためにより多くのエネルギー、したがってより高い温度を必要とします。

PCRのアニーリング温度は計算されたTmと同じにすべきですか？

いいえ。Tmはプライマーの半分だけが結合している点を示すため、ほとんどのプロトコルでは計算されたTmより数度低い温度から開始し、そこから調整します。

プライマーの長さはTmを変えますか？

はい。ただし、単純な関係ではありません。Marmur-Dotyの計算式では長さが分母に入るため、平均的なGC含量を持つ長いプライマーのTmが、GCに富む短いプライマーより自動的に高くなるわけではありません。

Tm計算機によって結果が異なるのはなぜですか？

使用する計算式が異なるためです。Wallace則、Marmur-DotyのGC含量計算式、最近接塩基対熱力学法、塩濃度補正式は、同じプライマーに対してそれぞれ異なるTmを示すことがあり、数度の差になる場合もあります。

参考文献

1. ROSALIND。What formula is used to calculate Melting Temperature (Tm)? ROSALIND Knowledge Hub — 14塩基未満の配列に対するWallace則、それより長い配列に対する式 Tm = 64.9 + 41 × (G + C − 16.4) / N、および50ナノモルのプライマー、50ミリモルのNa+、pH7.0という前提条件。
2. SantaLucia J Jr. A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. PMC19045 — 隣り合う塩基の組ごとの寄与を合計する最近接塩基対モデル。
3. Kibbe WA. OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator. Nucleic Acids Research, 2007. PMC1933198 — 8塩基から40塩基のオリゴヌクレオチドには最近接塩基対法が適しており、基本式は最も適さない。