ベクターとインサートの濃度、長さ、モル比を入力することで、DNAライゲーション反応の最適な体積を計算します。分子生物学や遺伝子工学に欠かせないツールです。
DNAリガーゼは、DNA断片を共有結合で結合するために使用される重要な分子生物学的技術です。 DNAリガーゼ計算機は、研究者にとって不可欠なツールであり、成功したリガーション反応に必要なベクターとインサートDNAの最適な量を決定するのに役立ちます。この計算機は、ベクター（プラスミド）とインサートDNA断片の間の正確なモル比を計算することにより、効率的な分子クローニング実験を保証し、試薬の無駄や失敗した反応を最小限に抑えます。
リガーション反応は、遺伝子工学、合成生物学、分子クローニング手順の基本です。これにより、科学者は遺伝子の挿入を行い、プラスミドベクターに挿入して、宿主生物に変換することができます。これらの反応の成功は、DNA成分の適切な量を使用することに大きく依存しており、まさにこの計算機がその決定を助けます。
発現ベクターの構築、遺伝子ライブラリの作成、またはルーチンのサブクローニングを行っている場合でも、このDNAリガーゼ計算機は実験条件を最適化し、成功率を高めるのに役立ちます。DNAサンプルに関するいくつかの重要なパラメータを入力することで、特定のリガーション反応に必要な正確な体積を迅速に取得できます。
DNAリガーゼ計算機は、結合されるDNA断片の異なるサイズと濃度を考慮した基本的な分子生物学の公式を使用します。主な計算は、ベクターDNAに対するインサートDNAの必要量を、各々の長さと望ましいモル比に基づいて決定します。
必要なインサートDNAの量（ナノグラム単位）は、次の公式を使用して計算されます：
ここで：
必要なインサートDNAの量が決定されたら、反応に必要な体積が計算されます：
実際の例を通して計算してみましょう：
ステップ1：必要なインサート量を計算します
ステップ2：体積を計算します
この計算により、反応中にベクター分子ごとに3つのインサート分子が存在することが保証され、リガーションの成功の可能性が最適化されます。
私たちのDNAリガーゼ計算機は、直感的で簡単に使用できるように設計されています。以下の手順に従って、リガーション反応の最適な体積を計算してください：
ベクター情報を入力：
インサート情報を入力：
反応パラメータを設定：
結果を表示：
結果をコピー（オプション）：
計算機は、すべての入力が正の数であること、および総体積が必要なDNA体積に対して十分であることを確認するための検証チェックを行います。エラーが検出された場合は、入力を修正するための役立つエラーメッセージが表示されます。
DNAリガーゼ計算機は、数多くの分子生物学的アプリケーションで価値があります：
最も一般的な使用例は、標準的な分子クローニングであり、研究者は遺伝子やDNA断片をプラスミドベクターに挿入します。計算機は以下の最適な条件を保証します：
合成生物学では、複数のDNA断片がしばしば組み合わされるため：
分子診断ツールを開発する際には：
タンパク質生産に取り組む研究者のために：
ゲノム編集アプリケーションにおいて：
計算機は特に難しいリガーションシナリオにとって価値があります：
私たちのDNAリガーゼ計算機は、従来のリガーション反応のための正確な計算を提供しますが、DNA断片を結合するためのいくつかの代替アプローチも存在します：
ギブソンアセンブリ：重複したDNA断片を結合するために、エクソヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、およびリガーゼを単一チューブ反応で使用します。従来のリガーション計算は必要ありませんが、濃度比は依然として重要です。
ゴールデンゲートアセンブリ：方向性のある、スカーなしの複数断片のアセンブリのためにタイプIIS制限酵素を使用します。すべての断片の等モル量が必要です。
SLIC（配列およびリガーション非依存クローニング）：エクソヌクレアーゼを使用して、相補的なオーバーハングを作成し、互いにアニーリングします。通常、断片の等モル比を使用します。
In-Fusionクローニング：オーバーラップのある断片を結合する商業システムです。断片サイズに基づく特定の比率を使用します。
ゲートウェイクローニング：リガーションの代わりに特異的な組換えを使用します。特定のエントリーおよびデスティネーションベクターが必要です。
経験的テスト：いくつかのラボでは、異なるインサート：ベクター比（1:1、3:1、5:1、10:1）で複数のリガーション反応を設定し、最適なものを決定することを好みます。
ソフトウェア計算機：Vector NTIやSnapGeneのような商業ソフトウェアパッケージには、制限部位分析などの追加機能を持つリガーション計算機が含まれています。
DNAリガーゼ計算の開発は、分子クローニング技術の進化と平行しており、これは分子生物学とバイオテクノロジーを革命的に変えました。
分子クローニングのためのDNAリガーゼの概念は、1970年代初頭にポール・バーグ、ハーバート・ボイヤー、スタンリー・コーエンの先駆的な研究によって生まれました。彼らは最初の組換えDNA分子を開発しました。この期間、リガーション反応は主に経験的であり、研究者は最適な条件を決定するために試行錯誤を行っていました。
制限酵素とDNAリガーゼの発見は、DNA分子を切断し再結合するための基本的なツールを提供しました。T4 DNAリガーゼは、T4バクテリオファージに感染した大腸菌から単離され、鈍端およびコヒーシブエンドの両方のDNA断片をリガートする能力から、標準的な酵素となりました。
分子クローニングがより一般的になるにつれて、研究者はリガーション反応に対するより体系的なアプローチを開発し始めました。ベクターとインサートDNAの間のモル比の重要性が明らかになり、今日でも使用されている基本的な公式の開発につながりました。
この期間中、研究者たちは、インサートDNAの過剰（通常3:1から5:1のモル比）が、標準的なクローニングアプリケーションのリガーション効率を一般的に改善することを確立しました。この知識は、最初はラボプロトコルを通じて共有され、徐々に分子生物学のマニュアルや教科書に取り入れられました。
2000年代に計算ツールやオンライン計算機の出現により、正確なリガーション計算が研究者にとってよりアクセスしやすくなりました。分子生物学的技術がより洗練されるにつれて、正確な計算の必要性がより重要になり、特に複数の断片や大きなインサートを含む難しいクローニングプロジェクトにおいてその必要性が高まりました。
今日、DNAリガーゼ計算は分子クローニングのワークフローの不可欠な部分であり、このような専用の計算機が研究者の実験を最適化するのを助けています。基本的な公式はほとんど変更されていませんが、リガーション効率に影響を与える要因に対する理解は向上しています。
ギブソンアセンブリやゴールデンゲートクローニングのような代替クローニング方法の出現は、新しい計算ニーズを導入しましたが、DNA断片間のモル比の基本的な概念は、これらの技術全体で依然として重要です。
以下は、さまざまなプログラミング言語でのDNAリガーゼ計算機の実装です：
1' Excel VBA関数：DNAリガーゼ計算機
2Function CalculateInsertAmount(vectorAmount As Double, vectorLength As Double, insertLength As Double, molarRatio As Double) As Double
3 ' 必要なインサート量をng単位で計算
4 CalculateInsertAmount = vectorAmount * (insertLength / vectorLength) * molarRatio
5End Function
6
7Function CalculateVectorVolume(vectorAmount As Double, vectorConcentration As Double) As Double
8 ' ベクター体積をμL単位で計算
9 CalculateVectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration
10End Function
11
12Function CalculateInsertVolume(insertAmount As Double, insertConcentration As Double) As Double
13 ' インサート体積をμL単位で計算
14 CalculateInsertVolume = insertAmount / insertConcentration
15End Function
16
17Function CalculateBufferVolume(totalVolume As Double, vectorVolume As Double, insertVolume As Double) As Double
18 ' バッファ/水の体積をμL単位で計算
19 CalculateBufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume
20End Function
21
22' セルでの使用例：
23' =CalculateInsertAmount(50, 3000, 1000, 3)
241def calculate_ligation_volumes(vector_concentration, vector_length, insert_concentration,
2 insert_length, molar_ratio, total_volume, vector_amount=50):
3 """
4 リガーション反応のための体積を計算します。
5
6 パラメータ：
7 vector_concentration (float): ベクターDNAの濃度（ng/μL）
8 vector_length (float): ベクターDNAの長さ（塩基対）
9 insert_concentration (float): インサートDNAの濃度（ng/μL）
10 insert_length (float): インサートDNAの長さ（塩基対）
11 molar_ratio (float): インサート：ベクターの望ましいモル比
12 total_volume (float): 総反応体積（μL）
13 vector_amount (float): 使用するベクターDNAの量（ng）（デフォルト：50）
14
15 戻り値：
16 dict: 計算された体積と量を含む辞書
17 """
18 # ベクター体積を計算
19 vector_volume = vector_amount / vector_concentration
20
21 # 必要なインサート量を計算
22 vector_length_kb = vector_length / 1000
23 insert_length_kb = insert_length / 1000
24 insert_amount = (vector_amount * insert_length_kb / vector_length_kb) * molar_ratio
25
26 # インサート体積を計算
27 insert_volume = insert_amount / insert_concentration
28
29 # バッファ/水の体積を計算
30 buffer_volume = total_volume - vector_volume - insert_volume
31
32 return {
33 "vector_volume": round(vector_volume, 2),
34 "insert_volume": round(insert_volume, 2),
35 "buffer_volume": round(buffer_volume, 2),
36 "insert_amount": round(insert_amount, 2),
37 "vector_amount": vector_amount
38 }
39
40# 使用例
41result = calculate_ligation_volumes(
42 vector_concentration=50,
43 vector_length=3000,
44 insert_concentration=25,
45 insert_length=1000,
46 molar_ratio=3,
47 total_volume=20
48)
49
50print(f"ベクター: {result['vector_volume']} μL ({result['vector_amount']} ng)")
51print(f"インサート: {result['insert_volume']} μL ({result['insert_amount']} ng)")
52print(f"バッファ: {result['buffer_volume']} μL")
53print(f"合計: 20 μL")
541function calculateLigationVolumes(vectorConcentration, vectorLength, insertConcentration,
2 insertLength, molarRatio, totalVolume, vectorAmount = 50) {
3 // 計算のために長さをkbに変換
4 const vectorLengthKb = vectorLength / 1000;
5 const insertLengthKb = insertLength / 1000;
6
7 // 必要なインサート量を計算
8 const insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
9
10 // 体積を計算
11 const vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
12 const insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
13 const bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
14
15 return {
16 vectorVolume: parseFloat(vectorVolume.toFixed(2)),
17 insertVolume: parseFloat(insertVolume.toFixed(2)),
18 bufferVolume: parseFloat(bufferVolume.toFixed(2)),
19 insertAmount: parseFloat(insertAmount.toFixed(2)),
20 vectorAmount: vectorAmount
21 };
22}
23
24// 使用例
25const result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
26console.log(`ベクター: ${result.vectorVolume} μL (${result.vectorAmount} ng)`);
27console.log(`インサート: ${result.insertVolume} μL (${result.insertAmount} ng)`);
28console.log(`バッファ: ${result.bufferVolume} μL`);
29console.log(`合計: 20 μL`);
301public class DNALigationCalculator {
2 public static class LigationResult {
3 public final double vectorVolume;
4 public final double insertVolume;
5 public final double bufferVolume;
6 public final double insertAmount;
7 public final double vectorAmount;
8
9 public LigationResult(double vectorVolume, double insertVolume, double bufferVolume,
10 double insertAmount, double vectorAmount) {
11 this.vectorVolume = vectorVolume;
12 this.insertVolume = insertVolume;
13 this.bufferVolume = bufferVolume;
14 this.insertAmount = insertAmount;
15 this.vectorAmount = vectorAmount;
16 }
17 }
18
19 public static LigationResult calculateLigationVolumes(
20 double vectorConcentration, double vectorLength,
21 double insertConcentration, double insertLength,
22 double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount) {
23
24 // 長さをkbに変換
25 double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
26 double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
27
28 // 必要なインサート量を計算
29 double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
30
31 // 体積を計算
32 double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
33 double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
34 double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
35
36 // 小数点以下2桁に丸める
37 vectorVolume = Math.round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
38 insertVolume = Math.round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
39 bufferVolume = Math.round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
40 insertAmount = Math.round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
41
42 return new LigationResult(vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount);
43 }
44
45 public static void main(String[] args) {
46 LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20, 50);
47
48 System.out.printf("ベクター: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.vectorVolume, result.vectorAmount);
49 System.out.printf("インサート: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.insertVolume, result.insertAmount);
50 System.out.printf("バッファ: %.2f μL%n", result.bufferVolume);
51 System.out.printf("合計: 20 μL%n");
52 }
53}
541#include <iostream>
2#include <cmath>
3#include <iomanip>
4
5struct LigationResult {
6 double vectorVolume;
7 double insertVolume;
8 double bufferVolume;
9 double insertAmount;
10 double vectorAmount;
11};
12
13LigationResult calculateLigationVolumes(
14 double vectorConcentration, double vectorLength,
15 double insertConcentration, double insertLength,
16 double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount = 50.0) {
17
18 // 長さをkbに変換
19 double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
20 double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
21
22 // 必要なインサート量を計算
23 double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
24
25 // 体積を計算
26 double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
27 double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
28 double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
29
30 // 小数点以下2桁に丸める
31 vectorVolume = std::round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
32 insertVolume = std::round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
33 bufferVolume = std::round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
34 insertAmount = std::round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
35
36 return {vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount};
37}
38
39int main() {
40 LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
41
42 std::cout << std::fixed << std::setprecision(2);
43 std::cout << "ベクター: " << result.vectorVolume << " μL (" << result.vectorAmount << " ng)" << std::endl;
44 std::cout << "インサート: " << result.insertVolume << " μL (" << result.insertAmount << " ng)" << std::endl;
45 std::cout << "バッファ: " << result.bufferVolume << " μL" << std::endl;
46 std::cout << "合計: 20 μL" << std::endl;
47
48 return 0;
49}
50インサートとベクターの最適なモル比は、通常、標準的なクローニングアプリケーションの場合、3:1から5:1の範囲です。ただし、これは特定のリガーションシナリオによって異なる場合があります：
リガーション効率に影響を与える要因は、モル比を超えていくつかあります：
通常、標準的なリガーション反応には50-100 ngのベクターDNAが推奨されます。あまりにも多くのベクターを使用すると、未切断または自己リガーションされたベクターの高いバックグラウンドが発生する可能性があり、逆に少なすぎると変換効率が低下する可能性があります。難しいリガーションの場合は、この量を最適化する必要があるかもしれません。
はい。鈍端リガーションは一般的にスティッキーエンド（コヒーシブエンド）リガーションよりも効率が低いです。鈍端リガーションの場合は、以下を使用します：
複数の断片のアセンブリの場合：
この計算機は、従来の制限酵素およびリガーゼベースのクローニング専用に設計されています。ギブソンアセンブリの場合、すべての断片の等モル量が一般的に推奨されますが、DNA量に基づく基本的な計算は似ています。ゴールデンゲートアセンブリの場合も、すべての構成要素の等モル比が通常使用されます。
ベクターの脱リン酸化（5'リン酸基の除去）は自己リガーションを防ぎますが、量の計算には影響しません。ただし、脱リン酸化されたベクターの場合：
最小の実用的な反応体積は通常10 μLであり、適切な混合を可能にし、蒸発の問題を防ぎます。計算されたDNA体積が希望する反応体積を超える場合、いくつかのオプションがあります：
最適なインキュベーション時間はリガーションの種類によって異なります：
はい、リガーション混合物は通常-20°Cで保存し、変換に再利用することができます。ただし、各フリーズ-スロース循環は効率を低下させる可能性があります。最良の結果を得るために：
Sambrook J, Russell DW. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Green MR, Sambrook J. (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Engler C, Kandzia R, Marillonnet S. (2008). A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS ONE, 3(11), e3647. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003647
Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. (2009). Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods, 6(5), 343-345. https://doi.org/10.1038/nmeth.1318
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Promega - Cloning Technical Manual. https://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/cloning/
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