DNAライゲーション計算ツール - 分子クローニングのためのインサート:ベクター比の計算

DNAライゲーションは、分子クローニングにおいて、酵素T4 DNAリガーゼによってインサート断片をプラスミドベクターに連結する工程である。DNAライゲーション計算機は、反応が設定したインサート対ベクターのモル比になるように、混合するインサートDNAとベクターDNAのマイクロリットル数を算出する。

計算機の機能

この計算機に入力するのは、ベクター濃度、ベクター長、インサート濃度、インサート長、目標とするインサート対ベクターのモル比、全反応液量の6項目である。使用するベクターDNA量も設定でき、初期値は50ナノグラム（ng）である。これらの値から、ピペットで分取するベクター量とインサート量、および全反応液量に達するために加える緩衝液または水の量を計算する。

濃度は1マイクロリットル当たりのナノグラム（ng/μL）で表し、通常はNanodropまたはQubitで測定する。長さは塩基対（bp）で表す。1キロベース（kb）は1000塩基対に相当する。モル比は、ベクター分子1個に対して存在させるインサート分子の数を示すものであり、質量の比ではない。

質量ではなくモル比を用いる理由

DNAは、質量が等しくても分子数が等しいとは限らない。同じ分子数で比較すると、短いインサートは長いベクターより軽い。短いインサートと長いベクターを同じナノグラム量で混合すると、ベクター分子に対してインサート分子が少なすぎることになる。計算機は断片長の比に基づいてインサートの質量を調整し、最終的な混合液でベクター分子1個当たりに意図した数のインサート分子が存在するようにする。

DNAライゲーションの計算式

必要なインサートDNA量（ナノグラム）は次のとおりである。

$m_i = m_v \times \frac{k_i}{k_v} \times R$

ここで、$m_i$はインサート量（ナノグラム）、$m_v$はベクター量（ナノグラム）、$k_i$はインサート長（キロベース）、$k_v$はベクター長（キロベース）を表し、Rはインサートとベクターの目標モル比を表す。

この量が分かれば、計算機はそれぞれの量をピペットで分取できる体積に換算する。

$V_v = \frac{m_v}{c_v}$

$V_i = \frac{m_i}{c_i}$

$V_b = V_t - V_v - V_i$

ここで、$V_v$と$V_i$はそれぞれベクターとインサートの体積（マイクロリットル）、$c_v$と$c_i$はそれぞれベクターとインサートの濃度（マイクロリットル当たりのナノグラム）、$V_b$はバッファーの体積、$V_t$は反応液の総体積を表す。

ベクター量とインサート量の合計が全反応液量を超えると、緩衝液、リガーゼ、または水を加える余地がなくなる。その場合、計算機は緩衝液量を負の値で表示するのではなく、全反応液量が小さすぎると報告する。

計算例

研究者が1 kbの遺伝子断片を3 kbのプラスミドベクターにクローニングするとする。50 ngのベクターDNAを、インサート対ベクターのモル比3:1で、20 μLの反応液に使用する計画である。

入力値：

• ベクター濃度：50 ng/μL
• ベクター長：3000 bp（3 kb）
• インサート濃度：25 ng/μL
• インサート長：1000 bp（1 kb）
• モル比：3
• 全反応液量：20 μL
• ベクター量：50 ng

ステップ1：インサート量

インサート量（ng）＝50×（1÷3）×3＝50 ng

ステップ2：体積

ベクター量＝50 ng÷50 ng/μL＝1 μL

インサート量＝50 ng÷25 ng/μL＝2 μL

緩衝液量＝20−1−2＝17 μL

反応液は、ベクター1 μL、インサート2 μL、緩衝液または水17 μLからなり、リガーゼとその反応緩衝液もここに加える。この混合液では、ベクター分子一つに対してインサート分子が3個存在する。

ライゲーションで一般的なモル比

粘着末端を持つ標準的なクローニングの多くでは、インサート対ベクターの比として3:1を用いる。平滑末端同士を連結するライゲーションは効率が低いため、5:1のような高い比率が一般的である。非常に大きなインサートでは、分子1個当たりに多くの塩基対がすでに含まれているため、1:1に近い低い比率のほうが適する場合がある。

よくある質問

DNAライゲーションとは何か？

DNAライゲーションとは、通常はプラスミドベクターとインサートという2つのDNA断片を連結し、1本の連続した分子にすることである。酵素T4 DNAリガーゼが、断片の末端同士を結合させる。

インサート対ベクターのモル比とは何か？

反応液中で、ベクター分子1個に対して存在するインサートDNA分子の数である。比3:1は、質量の比較に関係なく、ベクター分子1個に対してインサート分子が3個あることを意味する。

ベクターとインサートを同じナノグラム量にしないのはなぜか？

長さの異なるDNA断片は、1分子当たりの質量が異なる。1 kbのインサートは、分子ごとに比較すると、3 kbのベクターの約3分の1の重さである。それぞれを同じナノグラム量にしても分子数は等しくならないため、計算機は目標モル比に合うようにインサートの質量を調整する。

全反応液量が小さすぎるとはどういう意味か？

ベクターとインサートだけで反応液量全体を使い切り、緩衝液やリガーゼを加える余地がないという意味である。対処法は、全反応液量を増やすか、より高濃度のDNAストックを使用することである。

この計算機はGibson AssemblyやGolden Gateクローニングに使用できるか？

できない。これらの方法では異なる反応化学を用い、通常は固定したインサート対ベクター比ではなく、すべての断片を等モル量にすることを目標とする。体積の計算方法も、標準的なT4リガーゼを用いるクローニングとは異なる。

通常、ベクターDNAはどのくらい使用するか？

標準的なライゲーション反応では、50 ngが一般的な開始量である。DNA濃度と反応規模に応じて、25から100 ngの範囲の量を使用する研究室もある。