qPCR効率計算ツール：標準曲線分析ツール

qPCR効率計算機

qPCR効率計算機は、定量PCR（qPCR）反応が各増幅サイクルで標的DNA配列をどの程度効率よくコピーするかを推定します。希釈系列から得たCt値（蛍光シグナルが設定した閾値を超えるサイクル番号）を用いて、効率、傾き、切片、R²を計算します。

qPCR効率とは何か？

定量PCRでは、反応がサイクルごとに標的DNA配列をコピーする際の蛍光を追跡します。増幅効率は、各サイクルで標的DNA量がどの程度増加するかを表します。効率が100%の場合、標的DNA量は毎サイクル二倍になります。

実際の反応で効率が正確に100%になることはほとんどありません。多くの研究室では、信頼できる定量のために、90%から110%の間の効率を許容範囲としています。90%未満または110%を超える値は、プライマー設計不良、試料抽出時に持ち越されたPCR阻害物質、希釈系列のピペッティング誤差などの問題を示します。

効率は、試料間で遺伝子発現を比較する場合に特に重要です。一般的なΔΔCt法による相対変化量の計算では、すべての反応の効率が100%であると仮定します。測定された効率が100%と異なる場合、または標的遺伝子と参照遺伝子で効率が異なる場合、相対変化量の結果が不正確になることがあります。

qPCR効率の式

効率は、希釈系列における開始DNA量の底10対数（log10）に対してCt値をプロットして得られる標準曲線の傾きから計算します。

E = 10^(-1/slope) - 1

Eは効率で、十進数で表します（パーセント表示では100を掛けます）。slopeは標準曲線の直線の傾きです。開始DNA量が減少するとCtが増加するため、傾きは負になります。

傾き-3.32は、効率100%に相当します。

10^(-1/-3.32) - 1 = 10^0.301–1 ≈ 1.00

これは、反応でDNAが毎サイクル二倍になる場合、10倍希釈によってCtが約3.32サイクルずれるはずだからです。log2(10)はおよそ3.32です。

実際には、-3.1から-3.6の間の傾きが許容範囲とされます。この範囲は、およそ90%から110%の効率に相当します。傾きが-3.1に近いほど計算される効率は高くなり、-3.6に近いほど低くなります。

qPCR効率の計算方法：標準曲線法

希釈系列を調製します。最も濃度の高い試料から始め、後続の各試料を通常は10倍などの一定倍率で希釈します。各希釈液でqPCRを実施し、Ct値を記録します。
各希釈液をlog10値に変換します。最も濃度の高い最初の試料を位置0として、試料番号iのlog10（相対量）は、-i × log10（希釈倍率）となります。
すべての希釈液について、Ctを縦軸、log10値を横軸にプロットし、線形回帰を行います。
回帰直線の傾き、切片、R²を読み取ります。
傾きをE = 10^(-1/slope) - 1に代入して、効率を求めます。

標準曲線の品質基準

R²が少なくとも0.98。 点が直線にどの程度近く適合しているかを測定します。値が低い場合は、ピペッティング誤差や増幅の不均一性を示すことがあります。
傾きが-3.1から-3.6の間。 この範囲は、90–110%の効率に相当します。
少なくとも3つの希釈点。 5点または6点にすると、より信頼性の高い直線が得られ、外れ値も見つけやすくなります。
最も濃度の高い試料のCtは、およそ15-20になるはずです。最も希釈された試料はCt35未満に収める必要があります。これを超える値は検出限界に近づくためです。

計算例

5点の10倍希釈系列では、濃度の高い順に次のCt値が得られます：15.0、18.5、22.0、25.5、29.0。

log10（相対量）の値は0、-1、-2、-3、-4です。各希釈段階で-log10(10)、つまり-1が加わるためです。各段階でCtは3.5サイクル増加するので、点は直線上に並び、線形回帰によって次の結果が得られます。

傾き：-3.5
切片：15.0
R²：1.0

効率：E = 10^(-1/-3.5) - 1 = 10^0.286–1 ≈ 0.931、すなわち約93%。

効率93%、R² = 1.0は標準的な品質基準を満たしており、遺伝子発現の定量に適しています。

コード例

このJavaScript関数は、計算機と同じ方法に従います。最も濃度の高い最初の試料が最大の相対量を持ち、後の試料ほど希釈されているため、各Ct値のインデックスを否定してから対数を取ります。

1function qpcrEfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
2  // Sample 0 is most concentrated; each later sample is diluted further,
3  // so its log10(relative quantity) is negative.
4  const x = ctValues.map((_, i) => -i * Math.log10(dilutionFactor));
5  const n = ctValues.length;
6  let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0;
7  for (let i = 0; i < n; i++) {
8    sumX += x[i];
9    sumY += ctValues[i];
10    sumXY += x[i] * ctValues[i];
11    sumXX += x[i] * x[i];
12  }
13  const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
14  const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
15  const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
16  return { efficiency, slope, intercept };
17}
18
19qpcrEfficiency([15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0], 10);
20// => { efficiency: 93.07, slope: -3.5, intercept: 15 }
21

遺伝子発現で効率が重要な理由

ΔΔCt法を含む相対変化量の計算では、すべての反応で標的が各サイクルに二倍になると仮定します。標的遺伝子と参照遺伝子で測定された効率が異なる場合、単純なΔΔCt式では誤差が生じます。効率が約5パーセントポイントを超えて異なる場合、研究者はしばしば、2001年にMichael Pfafflが記述した方法など、効率補正を行う計算法に切り替えます。2009年に発表された、qPCRに関する広く引用されている報告基準であるMIQEガイドラインは、定量結果とともに計算された効率、傾き、R²を報告するよう推奨しています。

よくある質問

良好なqPCR効率の割合とは？

一般に90%から110%の間が許容され、十分に最適化されたアッセイでは95–105%付近になります。傾き-3.32は、正確に100%の効率に相当します。

qPCR効率が110%を超えるのはなぜか？

主な原因には、希釈系列のピペッティング誤差、プライマーダイマー、濃縮試料と希釈試料に不均一な影響を及ぼす阻害物質、増幅の指数期以外に設定された蛍光閾値などがあります。複数のピークを示す融解曲線は、プライマーダイマーを示唆することがあります。

qPCR効率が90%を下回るのはなぜか？

主な原因として、プライマー設計不良、試料抽出時に持ち越されたPCR阻害物質、アニーリング温度の不適切さなどが考えられます。プライマーの特異性を確認し、温度勾配を実施すると原因の特定に役立ちます。

R²値が低いとはどういう意味か？

R²は、Ct値がlog量に対してどの程度直線に適合するかを測定します。0.98未満の値は、ピペッティングの不均一性、阻害された試料、または検出限界に近い希釈点を示唆します。

標準曲線には何点の希釈点が必要か？

線形回帰に必要な最小数である3点以上です。5点または6点にすると、傾きの信頼性が高まり、外れ値も見つけやすくなります。

実験ごとに効率は変化するか？

変化します。新しい試薬ロット、新しいプライマーバッチ、異なる試料の種類、または異なるqPCR装置によって効率が変動することがあります。多くの研究室では、数か月ごと、または試薬ロットを新しくするたびに効率を再確認します。

参考文献

Bustin SA、Benes V、Garson JAほか。MIQEガイドライン：定量リアルタイムPCR実験の論文発表に必要な最小情報。Clinical Chemistry。2009;55(4):611-622。
Pfaffl MW。リアルタイムRT-PCRにおける相対定量の新しい数学モデル。Nucleic Acids Research。2001;29(9):e45。
Svec D、Tichopad A、Novosadova V、Pfaffl MW、Kubista M。PCR効率推定の精度評価：正確で信頼性の高いqPCR効率評価のための推奨事項。Biomolecular Detection and Quantification。2015;3:9-16。

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