タンパク質濃度計算ツール | A280から mg/mL への変換

タンパク質濃度計算機

タンパク質濃度計算機は、分光光度計で測定した光の吸光度を、溶液に溶解しているタンパク質の量に変換します。結果は通常、ミリグラム毎ミリリットル（mg/mL）またはマイクログラム毎ミリリットル（μg/mL）で示されます。この計算は、試料がどれだけ光を吸収するかと、含まれる物質の量との関係を示す化学の法則であるランベルト・ベールの法則に基づいています。

タンパク質濃度の測定方法

ほとんどのタンパク質は、280ナノメートル（nm）の波長の紫外線を強く吸収します。この吸収は主に、タンパク質の構造に含まれる2種類のアミノ酸、トリプトファンとチロシンによるものです。分光光度計は試料に光を照射し、試料がその光をどの程度吸収するかを測定します。この測定値は吸光度と呼ばれ、280 nmで測定した場合はA280と表されます。

280 nmでの吸光度測定は迅速で、試料を破壊しません。そのため、後述するブラッドフォード法やBCA法などの化学的手法とは異なります。この方法は、溶液中の精製タンパク質を対象とし、吸光度が約0.1から1.0の範囲にある場合に最も適しています。この範囲外の測定値は信頼性が低くなるため、測定前に試料を希釈することがよくあります。

タンパク質濃度の計算式

計算機は、濃度を求めるためにランベルト・ベールの法則を変形します。

C = (A × DF) / (ε × l)

• C — タンパク質濃度（mg/mL）
• A — 280 nmでの吸光度（単位のない数値）
• DF — 希釈係数。測定前に元の試料を何倍に希釈したかを示す
• ε — 吸光係数。タンパク質ごとに固有の定数で、単位はL/(g·cm)
• l — 光路長。光が試料中を通過する距離で、単位はcm（分光光度計で使用する小型のガラス製またはプラスチック製容器である標準キュベットでは、通常1 cm）

結果をマイクログラム毎ミリリットルに変換するには、mg/mLの値に1,000を掛けます。試料中のタンパク質の総質量を求めるには、濃度に試料の体積（ミリリットル）を掛けます。

計算例

ある試料の吸光度は、0.5、波長は280 nmでした。希釈は行っていないため、希釈係数は1です。また、標準的な1 cmキュベットで測定しました。このタンパク質はウシ血清アルブミン（BSA）で、吸光係数は0.667 L/(g·cm)です。

C = (0.5 × 1) / (0.667 × 1) ≈ 0.75 mg/mL

1 mLの試料では、これはタンパク質総量約0.75 mg、または750 μg/mLに相当します。

一般的なタンパク質の吸光係数

タンパク質ごとにトリプトファン残基とチロシン残基の数が異なるため、光の吸収量も異なります。吸光係数は、280 nmにおける特定のタンパク質の性質を、L/(g·cm)の単位で表したものです。よく使用される値には次のものがあります。

計算機では、この一覧にないタンパク質について、指定した吸光係数を使用することもできます。アミノ酸配列が既知のタンパク質では、Gillとvon Hippelが1989年に発表した式を使って、この値を推定できます。ε₂₈₀ =（トリプトファン残基数 × 5,500）+（チロシン残基数 × 1,490）+（シスチン残基数 × 125）。この式の結果はM⁻¹cm⁻¹で示されます。これはモル単位であり、上記の質量ベースのL/(g·cm)の値とは異なります。ExPASyサーバーで提供されているProtParamなどの無料ツールは、タンパク質配列からこの値を直接計算します。

光路長と希釈係数

光路長は、試料を入れるキュベットの幅で、センチメートル単位で測定します。標準キュベットの幅は1 cmです。ごく少量の試料を測定するマイクロボリューム分光光度計では、0.1 cmのように、より短い光路長を使用する場合があります。

希釈係数は、測定前に行った希釈を反映します。濃縮試料の吸光度が1.0を超える場合は、通常、あらかじめ緩衝液で希釈します。希釈係数は、希釈後の総体積を元の試料体積で割った値です。たとえば、試料10 μLと緩衝液990 μLを混合すると、総体積は1,000 μLとなり、希釈係数は100です。

タンパク質濃度を測定するその他の方法

280 nmでの吸光度測定は、実験室で一般的に用いられる複数の方法の1つです。

• ブラッドフォード法：タンパク質に結合すると色が変化する色素を使用します。未精製試料にも適していますが、色の変化はタンパク質の種類によって異なることがあります。
• BCA法：タンパク質のペプチド結合によって生じる色の変化を利用します。多くの界面活性剤と併用できますが、直接吸光度を測定する方法より実施に時間がかかります。
• ローリー法：古くからある方法で、感度は非常に高いものの、一部の一般的な緩衝液成分とは適切に反応しません。

これら3つの方法はいずれも試料を破壊します。直接A280を測定する方法では試料が破壊されないため、同じ試料を回収して再使用できます。

よくある質問

この方法に適した吸光度の範囲は？

0.1から1.0の間です。0.1未満では測定値が不正確になります。1.0を超えると、吸光度と濃度の関係が直線ではなくなる可能性があるため、まず試料を希釈する必要があります。

280 nmではなく260 nmで測定するのはなぜですか？

DNAやRNAなどの核酸は、260 nmで強く光を吸収します。タンパク質は、トリプトファンとチロシンを含むため、280 nmでより多くの光を吸収します。280 nmで測定すると、試料中に存在する核酸による干渉を抑えられます。

一覧にないタンパク質の吸光係数はどのように求めますか？

配列が既知のタンパク質では、ProtParamなどのツールがトリプトファン、チロシン、シスチン残基の数から吸光係数を計算します。また、試料の吸光度を既知濃度の溶液と比較して、直接測定することもできます。

この方法はタンパク質の混合物にも使えますか？

既知の吸光係数を持つ単一の精製タンパク質の場合に最も適しています。細胞溶解液など、未知のタンパク質が混在する試料では、通常、ブラッドフォード法またはBCA法を使用します。これらの方法のほうが、タンパク質総量をより一貫して推定できるためです。

界面活性剤は測定値に影響しますか？

はい。多くの界面活性剤は280 nm付近の光を吸収するため、結果が歪むことがあります。同じ濃度の界面活性剤を含むブランク試料を使用すると、その背景吸光度を相殺できます。界面活性剤の濃度が非常に高い場合は、BCA法など、界面活性剤に対応したアッセイが必要になることがあります。