Ląstelių skiedimo skaičiuoklė - Tikslus laboratorinis skiedimo įrankis

Ląstelių skiedimo skaičiuotuvas

Ląstelių skiedimo skaičiuotuvas nustato, kiek ląstelių suspensijos ir skiediklio reikia sumaišyti, kad pasirinkto galutinio tūrio suspensijoje būtų pasiekta tikslinė ląstelių koncentracija. Jis naudojamas ląstelių kultūroje, mikrobiologijoje ir kituose laboratoriniuose darbuose, kai prieš naudojimą mėginį reikia praskiesti iki tikslios koncentracijos.

Ką reiškia ląstelių skiedimas

Skiedžiant ląstelių suspensiją, joje esančių ląstelių skaičius nesikeičia. Pasikeičia tik tūris, kuriame yra ląstelės, todėl sumažėja koncentracija. Suspensijoje, kurios koncentracija yra 1 000 000 ląstelių mililitre (ląstelių/ml), po praskiedimo išlieka toks pats bendras ląstelių skaičius. Jis tiesiog pasiskirsto didesniame skysčio kiekyje.

Laboratorijose ląstelės skiedžiamos prieš daugelį įprastų veiksmų: augančios kultūros persėjimą į naujas kolbas, nustatyto ląstelių skaičiaus pasėjimą į kiekvieną plokštelės šulinėlį, ląstelių užšaldymą saugojimui arba mėginio paruošimą ląstelių skaitikliui ar srauto citometrui.

Ląstelių skiedimo formulė

Skaičiavimas grindžiamas viena taisykle. Iš pradinės suspensijos paimtų ląstelių skaičius, padaugintas iš jų koncentracijos, turi būti lygus ląstelių skaičiui galutiniame tūryje, padaugintam iš tikslinės koncentracijos:

C₁ × V₁ = C₂ × V₂

• C₁ — pradinė (atsargos suspensijos) koncentracija, ląstelėmis/ml
• V₁ — naudojamas atsargos suspensijos tūris, ml
• C₂ — tikslinė koncentracija, ląstelėmis/ml
• V₂ — reikalingas bendras galutinis tūris, ml

Išreiškus V₁, gaunamas pipete paimamas pradinės suspensijos tūris:

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁

Likusią galutinio tūrio dalį sudaro skiediklis, paprastai ląstelių kultūros terpė, fosfatu buferizuotas fiziologinis tirpalas (PBS) arba kitas buferis:

Skiediklio tūris = V₂ − V₁

Tikslinė koncentracija (C₂) niekada negali būti didesnė už pradinę koncentraciją (C₁). Skiedžiant koncentracija tik mažėja. Norint ją padidinti, ląsteles reikia centrifuguoti, nusodinti ir resuspenduoti mažesniame skysčio tūryje.

Kaip apskaičiuoti ląstelių skiedimą

1. Suskaičiuokite ląsteles atsargos suspensijoje hemocitometru arba automatiniu ląstelių skaitikliu, kad gautumėte C₁.
2. Užrašykite protokole nurodytą tikslinę koncentraciją C₂.
3. Nustatykite reikalingą bendrą galutinį tūrį V₂.
4. Apskaičiuokite V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁.
5. Apskaičiuokite skiediklio tūrį: V₂ − V₁.
6. Įtraukite į mėgintuvėlį V₁ atsargos suspensijos, tada įpilkite reikiamą terpės arba buferio skiediklio tūrį.

Skaičiavimo pavyzdys

Atsargos suspensijos koncentracija yra 1 000 000 ląstelių/ml. Pagal protokolą galutiniame 10 mL tūryje turi būti 100 000 ląstelių/ml.

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁ = (100 000 × 10) ÷ 1 000 000 = 1 000 000 ÷ 1 000 000 = 1 mL

Skiediklio tūris = V₂ − V₁ = 10 − 1 = 9 mL

Paėmus 1 mL atsargos suspensijos ir įpylus 9 mL terpės, gaunama 10 mL suspensijos, kurios koncentracija yra 100 000 ląstelių/ml.

Antrasis pavyzdys

Atliekant tyrimą 96 šulinėlių plokštelėje, kiekviename šulinėlyje reikia 10 000 ląstelių ir 200 mikrolitrų (μL) terpės. Tai atitinka 50 000 ląstelių/ml tikslinę koncentraciją, nes 10 000 ląstelių, padalytų iš 0,2 mL, yra 50 000 ląstelių/ml. Atsargos suspensijos koncentracija yra 2 000 000 ląstelių/ml, o visai plokštelei ir šiek tiek papildomo tūrio dėl pipetavimo nuostolių reikia 20 mL.

V₁ = (50 000 × 20) ÷ 2 000 000 = 1 000 000 ÷ 2 000 000 = 0,5 mL

Skiediklio tūris = 20 − 0,5 = 19,5 mL

Sumaišius 0,5 mL atsargos suspensijos su 19,5 mL terpės, gaunama 20 mL suspensijos, kurios koncentracija yra 50 000 ląstelių/ml; tai yra skiedimas santykiu 1:40.

Klaidų šaltiniai

Pati formulė yra be klaidų. Klaidos atsiranda dėl į ją įvestų skaičių.

• Skaičiavimo klaida. Neteisingai suskaičiavus ląsteles, neteisingas bus ir visas skiedimas. Ši rizika sumažėja suskaičiavus visus keturis hemocitometro tinklelio kampinius kvadratus ir apskaičiavus jų vidurkį.
• Sulipusios ląstelės. Ląstelių sankaupa pro mikroskopą atrodo kaip viena ląstelė, nors iš tikrųjų ją sudaro kelios, todėl tariama koncentracija sumažėja.
• Pipetės tūrio diapazonas. Naudojant pipetę už jos nurodyto tūrio diapazono ribų, gaunami netikslūs rezultatai. 1000 μL pipetė, nustatyta išleisti 5 μL, nėra patikima; vietoj jos reikia naudoti mažesnę pipetę.
• Vienetų supainiojimas. Sumaišius ląstelių/ml ir ląstelių/μl vienetus, gaunama klaida, kuri yra tūkstantį kartų per didelė arba per maža.
• Negyvos ląstelės. Į bendrą ląstelių skaičių įtraukiamos ir negyvos ląstelės, nebent buvo panaudotas gyvybingumo dažiklis, pavyzdžiui, tripano mėlynasis. Dėl to gali būti pervertintas iš tikrųjų esančių gyvų ląstelių skaičius.

Šio skaičiuotuvo ribos

Skaičiuotuvas atmeta skaičius, kurių negalima prasmingai panaudoti:

• Kiekviena reikšmė turi būti didesnė už nulį.
• Tikslinė koncentracija negali būti didesnė už pradinę koncentraciją.
• Pradinė koncentracija turi būti ne didesnė kaip 1 trilijono ląstelių/ml (1 × 10¹²).
• Apskaičiuotas atsargos suspensijos tūris turi būti ne mažesnis kaip 0,001 mL, tai yra 1 mikrolitras. Mažesnio tūrio negalima tiksliai įtraukti pipete, todėl skaičiuotuvas prašo įvesti kitus skaičius. Paprastai tai galima išspręsti padidinus bendrą tūrį.

Tūriai rodomi dviejų skaitmenų po kablelio tikslumu, o kai atsargos suspensijos tūris mažesnis nei 0,01 mL, – trijų skaitmenų po kablelio tikslumu, todėl mažas tūris niekada nerodomas kaip 0,00 mL.

Dažnai užduodami klausimai

Kokia yra ląstelių skiedimo formulė?

C₁ × V₁ = C₂ × V₂, kur C₁ ir C₂ yra pradinė ir tikslinė koncentracijos, o V₁ ir V₂ – iš atsargos suspensijos paimtas tūris ir bendras galutinis tūris.

Ar tikslinė koncentracija gali būti didesnė už pradinę koncentraciją?

Ne. Skiedžiant koncentracija tik mažėja. Norint pasiekti didesnę koncentraciją, ląsteles reikia centrifuguoti ir resuspenduoti mažesniame tūryje.

Kokį skystį naudoti ląstelėms skiesti?

Naudojama visavertė kultivavimo terpė, kai ląstelės turi išlikti gyvybingos kelias valandas ar dienas, pavyzdžiui, prieš jas pasėjant į plokštelę. PBS arba panašus buferinis fiziologinis tirpalas tinka trumpalaikiam, trumpesniam nei maždaug 30 minučių, skiedimui prieš tolesnį ląstelių apdorojimą. Terpė be serumo naudojama tada, kai serumo baltymai trukdytų vėlesniam tyrimui.

Ar ši formulė tinka bakterijoms arba mielėms?

Taip. C₁V₁ = C₂V₂ taikoma bet kokiai dalelių suspensijai, įskaitant bakterijas, matuojamas kolonijas sudarančiais vienetais mililitre (CFU/ml), mieles ir virusines daleles, matuojamas apnašas sudarančiais vienetais mililitre (PFU/ml), jei abiejose lygties pusėse naudojami tie patys vienetai.

Ar skiedžiant reikia skaičiuoti negyvas ląsteles?

Sėjant gyvą kultūrą reikia skaičiuoti tik gyvybingas ląsteles. Jei suspensijos gyvybingumas yra 80 %, jos gyvybingų ląstelių koncentracija lygi 0,8 bendro ląstelių skaičiaus, ir ši gyvybingų ląstelių koncentracija turi būti naudojama kaip C₁.

Kaip tiksliai paruošti labai didelius skiedimus?

Dideli skiedimai, pavyzdžiui, 1:1000, paprastai atliekami keliais mažesniais etapais, vadinamais nuosekliaisiais skiedimais. Trys iš eilės atliekami skiedimai santykiu 1:10 sudaro bendrą 1:1000 skiedimą, o kiekvienas pipetavimo etapas išlieka tikslaus tūrio diapazone.