Serijinių skiedimų skaičiuoklė - Laboratorinių koncentracijų įrankis

Serijinio skiedimo skaičiuotuvas nustato medžiagos koncentraciją kiekviename skiedimo serijos etape. Serijinis skiedimas – laboratorinis metodas, kai tirpalo koncentracija mažinama vienodais nuosekliais etapais, kiekvieną naują etapą skiedžiant tuo pačiu koeficientu kaip ir ankstesnį.

Kas yra serijinis skiedimas?

Serijinis skiedimas padeda išspręsti dažną laboratorijos problemą: mėginys yra per daug koncentruotas, kad jį būtų galima tiesiogiai išmatuoti ar naudoti. Užuot vienu etapu matavęs labai mažą, todėl paklaidoms jautrų tūrį, mokslininkas mėginį kelis kartus iš eilės praskiedžia, kiekviename etape naudodamas nedidelį ir lengvai valdomą tūrį.

Kiekvienas skiedimas pradedamas nuo ankstesnio etapo rezultato, o ne nuo pradinio mėginio. Taip sudaroma koncentracijų serija, kurioje koncentracija kaskart sumažėja tuo pačiu koeficientu. Šis metodas naudojamas bakterijoms skaičiuoti, vaistų poveikiui ląstelėms esant skirtingoms dozėms tirti, laboratorinių tyrimų kalibravimo kreivėms sudaryti ir DNR mėginiams PGR paruošti.

Serijinio skiedimo formulė

Kiekvienam skiedimo etapui taikoma ši formulė:

$C_2 = \frac{C_1}{DF}$

• C₁ – koncentracija prieš etapą
• DF – skiedimo koeficientas
• C₂ – koncentracija po etapo

Norėdami iš karto rasti koncentraciją po kelių etapų, naudokite:

$C_n = \frac{C_0}{DF^n}$

• C₀ – pradinė koncentracija
• DF – skiedimo koeficientas
• n – etapų skaičius
• C_n – koncentracija po n etapų

Skiedimo koeficientas turi būti didesnis už 1. Koeficientas 1 reikštų, kad skiedimo apskritai nėra. Pradinė koncentracija turi būti didesnė už 0.

Šis skaičiuotuvas apima nuo 1 iki 20 etapų ir greta jų pateikia 0 etapą, t. y. nepraskiestą mėginį. Koncentracijos vienetas nurodomas paprasto teksto etikete, pavyzdžiui, mg/mL arba CFU/mL, ir kiekviena eilutė pateikiama tuo pačiu vienetu. Koncentracijos rodomos šešių reikšminių skaitmenų tikslumu, o reikšmėms, mažesnėms už 0,000001, taikomas mokslinis užrašas, kad mažas rezultatas niekada nebūtų rodomas kaip nulis.

Skiedimo koeficientas ir skiedimo santykis

Skiedimo koeficientas 10 dažnai užrašomas kaip santykis 1:10. Santykis apibūdina proporcijas, o ne patį koeficientą: 1 dalis mėginio ir 9 dalių skiediklio sudaro iš viso 10 dalių. Koeficientas nurodo, kiek kartų naujasis tirpalas yra labiau praskiestas, todėl santykis 1:10 reiškia skiedimo koeficientą 10, o ne 11.

Įprasti skiedimo koeficientai:

• 10 (1:10): standartinis pasirinkimas mikrobiologijoje, nes keliais etapais apima platų koncentracijų intervalą.
• 2 (1:2): dažnas farmakologijoje, kai dozės ir poveikio kreivei sudaryti reikia smulkesnių etapų.
• 5 (1:5): tarpinis variantas, suteikiantis daugiau duomenų taškų nei 1:10, bet reikalaujantis mažiau etapų nei 1:2.

Pavyzdys: bakterijų kultūros skiedimas

Skystoje kultūroje yra apytiksliai 10⁸ kolonijas sudarančių vienetų (CFU) mililitre, todėl ji per tanki, kad ją būtų galima tiesiogiai suskaičiuoti. Vienoje lėkštelėje turi būti nuo 30 iki 300 kolonijų, todėl mėginį reikia skiesti serijiniu būdu santykiu 1:10, atliekant 6 etapus.

Pasėjus 100 μL (0,1 mL) iš 5 etapo, lėkštelėje bus maždaug 10² = 100 CFU, t. y. skaičiuoti tinkamas kiekis.

Pavyzdys: dvigubo skiedimo serija vaistui

Tikimasi, kad vaisto IC50 (koncentracija, perpus sumažinanti aktyvumą) bus maždaug 25 mg/mL. Norint ištirti šios vertės intervalą, reikia serijos, skiedžiamos santykiu 1:2, pradedant nuo 100 mg/mL ir atliekant 5 etapus.

Ši serija apima tikėtiną IC50 reikšmę ir suteikia pakankamai taškų dozės ir poveikio kreivei sudaryti.

Kaip atlikti serijinį skiedimą

1. Prieš pradėdami paženklinkite kiekvieną mėgintuvėlį etapo numeriu ir skiedimo koeficientu.
2. Į kiekvieną mėgintuvėlį, išskyrus tą, kuriame yra pradinis mėginys, įpilkite skiediklio. Serijai, kurios skiedimo santykis 1:10, įpilkite 9 tūrio dalių skiediklio į 1 tūrio dalį, skirtą mėginiui.
3. Išmatuotą pradinio mėginio tūrį perkelkite į pirmąjį mėgintuvėlį ir kruopščiai išmaišykite – naudodami sūkurinį maišytuvą arba kelis kartus pipete įsiurbdami ir išstumdami skystį.
4. Naudodami naują antgalį, perkelkite tokį patį tūrį iš pirmojo mėgintuvėlio į antrąjį ir vėl išmaišykite.
5. Pakartokite perkėlimo ir maišymo veiksmus su kiekvienu likusiu mėgintuvėliu.
6. Praskiestus mėginius naudokite nedelsdami, nes gyvos ląstelės toliau auga, o kai kurie junginiai laikui bėgant suyra.

Kur naudojamas serijinis skiedimas

Mikrobiologijoje serijinis skiedimas naudojamas bakterijų kolonijoms skaičiuoti lėkštelėse ir minimaliai slopinamai koncentracijai (MIC) nustatyti – tai mažiausia antibiotiko dozė, sustabdanti bakterijų augimą. Biochemijoje jis naudojamas baltymų tyrimų standartinėms kreivėms sudaryti ir tinkamos koncentracijos DNR matricoms paruošti PGR. Farmakologijoje skiedimo serijos naudojamos vaistams tirti įvairiomis dozėmis ir tokioms reikšmėms kaip IC50 apskaičiuoti. Imunologijoje jos naudojamos ELISA kalibravimo kreivėms sudaryti ir antikūnų titracijai, kuria nustatomas didžiausias skiedimas, vis dar sukeliantis teigiamą rezultatą.

Dažnos klaidos

Prastas kiekvieno mėgintuvėlio sumaišymas yra dažna klaidų priežastis, nes dalelės ir ląstelės gali nusėsti, užuot išlikusios tolygiai pasiskirsčiusios. Pakartotinai naudojamas pipetės antgalis gali pernešti pakankamai medžiagos iš labiau koncentruoto mėgintuvėlio, kad būtų iškraipyti vėlesni rodmenys. Supainiojus skiedimo santykį su skiedimo koeficientu, parenkami netinkami tūriai: skiedimas santykiu 1:10 reiškia 1 dalį mėginio ir 9 dalis skiediklio, o ne 1 dalį ir 10. Jei koncentracija apvalinama kiekviename etape, o ne galutinė reikšmė tiesiogiai apskaičiuojama pagal C₀/DF^n, keliuose etapuose gali susikaupti pastebima paklaida.

Istorija

Robertas Kochas 1880-aisiais, tirdamas tuberkuliozę ir cholerą, sukūrė kiekybinius bakterijų kolonijų skaičiavimo metodus ir padėjo pagrindus iki šiol naudojamam skaičiavimo lėkštelėse metodui. Heinricho Schnitgerio 1957 metais išrasta oro poslinkio mikropipetė vėliau leido tiksliai matuoti mikrolitrų tūrius, todėl molekulinėje biologijoje ir imunologiniuose tyrimuose tapo įmanoma praktiškai atlikti tikslias, atkuriamas skiedimo serijas.

Dažnai užduodami klausimai

Kaip apskaičiuoti serijinį skiedimą? Naudokite C_n = C₀ / DF^n, kur C₀ yra pradinė koncentracija, DF – skiedimo koeficientas, o n – etapų skaičius. Pavyzdžiui, 100 mg/mL koncentraciją praskiedus koeficientu 10 per 3 etapus, gaunama 100 / 10³ = 0,1 mg/mL.

Kuo skiriasi skiedimo koeficientas ir skiedimo santykis? Skiedimo santykis, pavyzdžiui, 1:10, apibūdina dalis: 1 dalis mėginio sumaišoma su 9 dalimis skiediklio, iš viso gaunant 10 dalių. Skiedimo koeficientas yra pats skaičius 10, reiškiantis, kad tirpalas yra dešimt kartų mažesnės koncentracijos.

Kodėl verta naudoti kelis mažus skiedimo etapus, o ne vieną didelį? Mažus vienodo tūrio kiekius pipete paimti tiksliau nei vienu etapu atlikti labai didelį skiedimą. Šeši 1:10 skiedimo etapai taip pat leidžia pasiekti milijoną kartų mažesnę koncentraciją – intervalą, kurį vienu etapu tiksliai pasiekti sunku.

Koks yra serijinio skiedimo tikslumas? Naudojant sukalibruotas pipetes ir kruopščiai dirbant, serijos tikslumas paprastai siekia nuo 5 iki 10 procentų, todėl toks metodas tinka daugumai mikrobiologinių darbų. Kai reikia didesnio tikslumo, pavyzdžiui, ruošiant farmacinius standartus, dažnai naudojami lygiagretūs skiedimai, kiekvieną kartą tiesiogiai ruošiami iš pradinio tirpalo.

Koks yra didžiausias naudingas skiedimo etapų skaičius? Šis skaičiuotuvas leidžia atlikti iki 20 etapų. Daugumoje laboratorinių protokolų naudojama nuo 6 iki 10 etapų, nes su kiekvienu papildomu perkėlimu paklaida didėja. Didesnis skiedimo koeficientas sumažina reikalingų etapų skaičių; pavyzdžiui, trys 1:100 etapai pasiekia tokį patį 10⁻⁶ skiedimą kaip šeši 1:10 etapai.

Ar toje pačioje serijoje skiedimo koeficientas gali keistis tarp etapų? Taip, tačiau daugumoje protokolų koeficientas išlaikomas pastovus, nes pastovų koeficientą paprasčiau apskaičiuoti, pipetuoti ir atkartoti. Kintamas koeficientas kartais naudojamas, kai vienai koncentracijų intervalo daliai reikia didesnės skiriamosios gebos nei kitai.