Kalibravimo kreivės skaičiuoklė | Tiesinė regresija laboratoriniams tyrimams

Kas yra kalibravimo kreivės skaičiuotuvas

Kalibravimo kreivės skaičiuotuvas prietaiso rodmenis paverčia koncentracijomis. Jis tai atlieka per duomenų taškus, gautus iš žinomos koncentracijos standartų, nubrėždamas geriausiai tinkančią tiesę, o tada pagal ją naują rodmenį paversdamas koncentracija. Laboratorijose kalibravimo kreivės naudojamos chemijoje, biologijoje ir aplinkos tyrimuose, kai prietaisas vietoj koncentracijos tiesiogiai pateikia signalą, pavyzdžiui, sugertį arba smailės plotą.

Šiame puslapyje esantis skaičiuotuvas tiesę pritaiko taikydamas tiesinę regresiją, t. y. mažiausių kvadratų metodą. Jis pateikia nuolydį, laisvąjį narį ir R² – dydį, rodantį, kaip tiksliai taškai atitinka tiesę. Tada pagal išmatuotą atsaką jis gali įvertinti nežinomo mėginio koncentraciją.

Kalibravimo kreivės formulė

Kalibravimo kreivė grindžiama tiesine priklausomybe tarp koncentracijos ir prietaiso atsako:

$y = mx + b$

• $y$ yra atsakas (tai, ką išmatuoja prietaisas)
• $x$ yra koncentracija
• $m$ yra nuolydis
• $b$ yra y ašies laisvasis narys

Kaip apskaičiuoti nuolydį ir sankirtą

Turint $n$ taškų, geriausiai duomenis atitinkantis nuolydis ir sankirta (mažiausių kvadratų prasme) yra:

$m = \frac{\sum_{i=1}^{n}(x_i - \bar{x})(y_i - \bar{y})}{\sum_{i=1}^{n}(x_i - \bar{x})^2}$

$b = \bar{y} - m\bar{x}$

Čia $\bar{x}$ ir $\bar{y}$ yra visų taškų vidutinė koncentracija ir vidutinis atsakas.

R² formulė

R², determinacijos koeficientas, parodo, kaip gerai tiesė atitinka duomenis:

$R^2 = 1 - \frac{\sum_{i=1}^{n}(y_i - \hat{y}_i)^2}{\sum_{i=1}^{n}(y_i - \bar{y})^2}$

$\hat{y}_i$ yra atsakas, kurį tiesė prognozuoja kiekvienai $x_i$ reikšmei. R² reikšmės svyruoja nuo 0 iki 1. Reikšmė 1 reiškia, kad kiekvienas taškas tiksliai yra ant tiesės.

Nežinomos koncentracijos formulė

Kai nuolydis ir sankirta žinomi, išmatuotą atsaką $y$ galima perskaičiuoti į koncentraciją:

$x = \frac{y - b}{m}$

Jei apskaičiuojamas neigiamas skaičius, skaičiuotuvas pateikia koncentraciją 0, nes neigiama koncentracija fiziškai neturi prasmės. Jis taip pat pateikia 0, kai pritaikytos tiesės nuolydis yra 0, nes horizontali tiesė nesuteikia informacijos apie koncentraciją.

Skaičiavimo pavyzdys

Tarkime, kad keturi standartai davė toliau pateiktus rezultatus:

Vidutinė koncentracija yra 3, o vidutinis atsakas – 0,20.

Nuolydis:

$m = \frac{(-3)(-0.15) + (-1)(-0.05) + (1)(0.04) + (3)(0.16)}{(-3)^2 + (-1)^2 + 1^2 + 3^2} = \frac{1.02}{20} = 0.0510$

Sankirta:

$b = 0.20 - (0.0510)(3) = 0.0470$

R²: palyginus prognozuojamus atsakus su faktiniais, gaunama R² = 0,9966.

Pritaikyta tiesė yra:

$y = 0.0510x + 0.0470 \quad (R^2 = 0.9966)$

Tarkime, kad nežinomo mėginio atsakas yra 0,20. Jo koncentracija yra:

$x = \frac{0.20 - 0.0470}{0.0510} = 3.0000$

Kaip naudoti šią skaičiuoklę

1. Įveskite kiekvieno standarto žinomą koncentraciją ir išmatuotą atsaką kaip skaičių porą. Skaičiuotuvas pradžioje pateikia dvi eilutes.
2. Pasirinkite „Pridėti duomenų tašką“, jei norite įvesti daugiau standartų, arba šalia eilutės pasirinkite „Pašalinti duomenų tašką“, kad ją ištrintumėte. Reikia mažiausiai dviejų taškų.
3. Užpildžius bent du taškus, skaičiuotuvas rodo regresijos lygtį, R² reikšmę ir taškų grafiką su pritaikyta tiesė. Nuolydis, sankirta, R² ir koncentracija pateikiami suapvalinti iki keturių skaitmenų po kablelio.
4. Laukelyje „Apskaičiuoti nežinomą koncentraciją“ įveskite išmatuotą atsaką, kad pamatytumėte atitinkamą koncentraciją. Ji atnaujinama automatiškai įvedant reikšmę; atskiro mygtuko spausti nereikia.
5. Pasirinkite „Atkurti“, kad išvalytumėte visus įvestus taškus ir atsako lauką bei pradėtumėte iš naujo.

Nuolydžio, laisvojo nario ir R² interpretavimas

Nuolydis rodo, kiek pasikeičia atsakas koncentracijai pasikeitus vienu vienetu. Didesnis nuolydis reiškia, kad metodas stipriai reaguoja į nedidelius koncentracijos pokyčius.

Laisvasis narys yra prognozuojamas atsakas esant nulinei koncentracijai. Ji atspindi foninį signalą, pavyzdžiui, tuščiojo mėginio arba prietaiso bazinę liniją. Nenulinis laisvasis narys yra įprastas ir savaime nereiškia problemos, tačiau didelis arba tarp kalibravimų kintantis laisvasis narys gali rodyti užterštumą arba prietaiso gedimą.

R² rodo, kaip tiksliai taškai atitinka tiesę. Gerai veikiančiam tiesiniam metodui įprastos reikšmės, didesnės už 0,99. Mažesnė R² reikšmė gali reikšti pipetavimo klaidą, pablogėjusios kokybės standartą arba koncentracijos intervalą, kuriame atsakas nebėra tiesinis.

Kur naudojamos kalibravimo kreivės

Kalibravimo kreivės dažnai naudojamos visur, kur neapdorotą prietaiso signalą reikia paversti koncentracija:

• Spektrofotometrija — išmatuota šviesos sugertis paverčiama koncentracija, pavyzdžiui, nustatant baltymų arba pigmentų kiekį.
• Chromatografija (HPLC, GC) — chromatogramos smailės plotas arba aukštis paverčiamas koncentracija; tai dažnai taikoma vaistų tyrimuose ir aplinkos analizėje.
• ELISA ir kiti imuniniai tyrimai — plokštelių skaitytuvu išmatuotas spalvos arba fluorescencijos intensyvumas paverčiamas antigeno arba antikūno koncentracija.
• qPCR — ciklo slenksčio reikšmės, gautos skiedžiant žinomo mėginio tirpalą, sudaro kreivę, pagal kurią įvertinamas genetinės medžiagos kiekis nežinomame mėginyje.

Kai tiesė netinka

Kai kurie metodai visame intervale nėra tiesiniai. Dažniausiai kalibravimas apribojamas siauresniu tiesiniu intervalu, prieš tiesės pritaikymą taikoma logaritminė transformacija, naudojamas polinominis (kreivės) modelis arba svertinė regresija, kai matavimo paklaida didėja ar mažėja keičiantis koncentracijai. Šis skaičiuotuvas pritaiko tik tiesę; jei taškai aiškiai sudaro kreivę, rezultatai bus mažiau patikimi ir gali reikėti kito modelio.

Dažnai užduodami klausimai

Kas yra kalibravimo kreivė?

Kalibravimo kreivė yra tiesė, pritaikyta prie prietaiso rodmenų, gautų tiriant žinomos koncentracijos mėginius. Ji naudojama naujam nežinomos koncentracijos mėginio rodmeniui paversti koncentracijos reikšme.

Kiek duomenų taškų reikia kalibravimo kreivei?

Kad pritaikytų tiesę, skaičiuotuvui reikia mažiausiai dviejų taškų, tačiau du taškai negali parodyti, ar tikroji priklausomybė iš tiesų yra tiesinė. Dauguma laboratorijų naudoja nuo penkių iki aštuonių standartų, apimančių numatomą nežinomų mėginių intervalą.

Ką reiškia R² kalibravimo kreivėje?

R² matuoja, kaip tiksliai duomenų taškai atitinka pritaikytą tiesę skalėje nuo 0 iki 1. Reikšmė 1 reiškia, kad kiekvienas taškas tiksliai yra ant tiesės. Didesnės nei 0,99 reikšmės paprastai laikomos stipriu tiesinės priklausomybės įrodymu.

Ar galima įvertinti koncentraciją už standartų intervalo ribų?

Įvertinti koncentraciją, mažesnę už mažiausio standarto arba didesnę už didžiausio standarto koncentraciją, nepatikima, nes nėra duomenų, patvirtinančių, kad ten tiesė išlieka tiesi. Geriau per daug koncentruotą mėginį praskiesti arba per mažos koncentracijos mėginį sukoncentruoti ir išmatuoti dar kartą kalibravimo intervale.

Kodėl apskaičiuota koncentracija kartais rodoma kaip 0?

Jei išmatuotas atsakas yra mažesnis už apskaičiuotą laisvąjį narį (esant teigiamam nuolydžiui), pagal formulę $x = (y - b) / m$ gaunamas neigiamas skaičius. Tokiu atveju skaičiuotuvas rodo 0, nes tikra koncentracija negali būti neigiama. Jis taip pat rodo 0, kai nuolydis yra 0; taip nutinka, jei visų standartų atsakas arba visų standartų koncentracija yra vienoda.

Kuo skiriasi nuolydis ir laisvasis narys?

Nuolydis apibūdina atsako jautrumą koncentracijos pokyčiui. Sankirta yra prognozuojamas atsakas esant nulinei koncentracijai; dažnai ji atspindi foninį signalą, o ne pačią analitę.