Aprēķiniet precīzus paraugu apjomus, pamatojoties uz BCA testu absorbances rādījumiem un vēlamo proteīnu masu. Nepieciešams konsekventai proteīnu ielādei rietumu blotēšanā un citās laboratorijas lietojumprogrammās.
Šis rīks aprēķina nepieciešamo paraugu tilpumu, pamatojoties uz BCA absorbcijas rezultātiem un parauga masu. Ievadiet absorbcijas vērtību un parauga masu katram paraugam, lai aprēķinātu atbilstošo parauga tilpumu.
Parauga tilpums tiek aprēķināts, izmantojot sekojošo formulu:
• tipAbsorbanceRange
• tipSampleMass
• tipSampleVolume
• tipStandardCurve
BCA Absorbance Paraugu Tilpuma Kalkulators ir specializēts rīks, kas izstrādāts, lai palīdzētu pētniekiem un laboratoriju tehniķiem precīzi noteikt atbilstošo paraugu tilpumu eksperimentiem, pamatojoties uz BCA (bicinchonīnskābes) analīzes rezultātiem. Šis kalkulators ņem vērā absorbances mērījumus no jūsu BCA analīzes un jūsu vēlamo paraugu masu, lai aprēķinātu precīzu tilpumu, kas nepieciešams konsekventai proteīnu slodzei tādās lietojumprogrammās kā rietumu blotēšana, enzīmu analīzes un citās proteīnu analīzes tehnikās.
BCA analīze ir viena no visplašāk izmantotajām metodēm proteīnu kvantificēšanai biochemijas un molekulārās bioloģijas laboratorijās. Mērot jūsu proteīnu paraugu absorbanci un salīdzinot to ar standarta līkni, jūs varat noteikt proteīna koncentrāciju ar augstu precizitāti. Mūsu kalkulators vienkāršo šo procesu, automātiski pārveidojot absorbances mērījumus par precīziem paraugu tilpumiem, kas nepieciešami jūsu eksperimentiem.
Bicinchonīnskābes (BCA) analīze ir bioķīmiska analīze, lai noteiktu kopējo proteīnu koncentrāciju šķīdumā. Šīs analīzes princips balstās uz Cu²⁺-proteīnu kompleksa veidošanos sārmainos apstākļos, kam seko Cu²⁺ samazināšana uz Cu¹⁺. Samazināšanas daudzums ir proporcionāls klātesošajam proteīnam. BCA veido purpura krāsas kompleksu ar Cu¹⁺ sārmainā vidē, nodrošinot pamatu, lai uzraudzītu vara samazināšanu ar proteīniem.
Purpura krāsas intensitāte palielinās proporcionāli ar proteīna koncentrāciju, ko var izmērīt, izmantojot spektrofotometru apmēram 562 nm. Tad absorbances mērījumi tiek salīdzināti ar standarta līkni, lai noteiktu proteīna koncentrāciju nezināmos paraugos.
Pamatformula paraugu tilpuma aprēķināšanai, pamatojoties uz BCA absorbances rezultātiem, ir:
Kur:
Proteīna koncentrācija tiek aprēķināta no absorbances mērījuma, izmantojot standarta līknes vienādojumu:
Tipiskajam BCA analīzes gadījumam slīpums parasti ir aptuveni 2.0, un intercepts bieži ir tuvu nullei, lai gan šīs vērtības var atšķirties atkarībā no jūsu specifiskajiem analīzes apstākļiem un standarta līknes.
Mūsu kalkulators vienkāršo paraugu tilpumu noteikšanas procesu, pamatojoties uz BCA analīzes rezultātiem. Izpildiet šos soļus, lai iegūtu precīzus aprēķinus:
Ievadiet Paraugu Informāciju:
Izvēlieties Standarta Līknes Veidu:
Skatiet Rezultātus:
Kopējiet vai Eksportējiet Rezultātus:
Pastaigāsimies cauri praktiskam piemēram:
Tas nozīmē, ka jums vajadzētu ielādēt 13.33 μL no jūsu parauga, lai iegūtu 20 μg proteīna.
Kalkulators sniedz vairākus svarīgus informācijas gabalus:
Proteīna Koncentrācija: Šī vērtība tiek aprēķināta no jūsu absorbances mērījuma, izmantojot izvēlēto standarta līkni. Tā attēlo proteīna daudzumu uz vienību tilpuma jūsu paraugā (μg/μL).
Paraugu Tilpums: Šis ir jūsu parauga tilpums, kas satur jūsu vēlamo proteīna daudzumu. Šī vērtība ir tā, ko jūs izmantosiet, gatavojot savus eksperimentus.
Brīdinājumi un Ieteikumi: Kalkulators var sniegt brīdinājumus par:
Viens no visbiežāk sastopamajiem šī kalkulatora lietojumiem ir paraugu sagatavošana rietumu blotēšanai. Konsekventa proteīnu slodze ir izšķiroša, lai nodrošinātu uzticamus rietumu blotu rezultātus, un šis kalkulators nodrošina, ka jūs ielādējat to pašu proteīna daudzumu katram paraugam, pat ja to koncentrācijas atšķiras.
Piemēra darba plūsma:
Enzīmu analīzēs bieži ir nepieciešams izmantot noteiktu proteīna daudzumu, lai standartizētu reakcijas apstākļus dažādiem paraugiem vai eksperimentiem.
Piemēra darba plūsma:
Imunoprecipitācijas (IP) eksperimentos ir svarīgi sākt ar konsekventu proteīna daudzumu, lai salīdzinātu rezultātus dažādās apstākļos.
Piemēra darba plūsma:
Proteīnu attīrīšanas procesā bieži ir nepieciešams izsekot proteīna koncentrāciju un aprēķināt ražību dažādos posmos.
Piemēra darba plūsma:
Lai gan kalkulators nodrošina noklusējuma parametrus standarta BCA analīzēm, jūs varat ievadīt arī pielāgotas vērtības, ja esat izveidojis savu standarta līkni. Tas ir īpaši noderīgi, ja:
Lai izmantotu pielāgotu standarta līkni:
Kalkulators ļauj pievienot vairākus paraugus un aprēķināt to tilpumus vienlaicīgi. Tas ir īpaši noderīgi, gatavojot paraugus eksperimentiem, kuros nepieciešama konsekventa proteīnu slodze visām nosacījumiem.
Partijas apstrādes priekšrocības:
Ja jūsu absorbances mērījums pārsniedz 2.0, tas var būt ārpus BCA analīzes lineārā diapazona. Šādos gadījumos:
Absorbances mērījumiem, kas ir zem 0.1, jūs varat būt tuvu analīzes noteikšanas robežai, kas var ietekmēt precizitāti. Apsveriet:
Ja kalkulators norāda uz tilpumu, kas ir pārāk liels jūsu lietojumam:
Precīza proteīnu kvantificēšana ir bijusi pamatprasība biochemijā un molekulārajā bioloģijā kopš šo jomu rašanās. Agrīnās metodes balstījās uz slāpekļa satura noteikšanu, kas bija laikietilpīga un prasīja specializētu aprīkojumu.
Kjeldahl Metode (1883): Viena no pirmajām proteīnu kvantificēšanas metodēm, kas balstās uz slāpekļa satura mērīšanu.
Biuret Tests (Agrie 1900 gadi): Šī metode balstās uz reakciju starp peptīdu saitēm un vara joniem sārmainā šķīdumā, radot violetu krāsu.
Lowry Analīze (1951): Izstrādājusi Olivija Lowry, šī metode apvienoja Biuret reakciju ar Folin-Ciocalteu reaģentu, palielinot jutību.
Bradford Analīze (1976): Mariona Bradford izstrādāja šo metodi, izmantojot Coomassie Brilliant Blue G-250 krāsvielu, kas saistās ar proteīniem un pārvieto absorbcijas maksimumu.
BCA Analīze (1985): Izstrādāta Pola Smita un kolēģu pie Pierce Chemical Company, šī metode apvienoja biuret reakciju ar BCA noteikšanu, piedāvājot uzlabotu jutību un saderību ar mazgāšanas līdzekļiem.
BCA analīze pirmo reizi tika aprakstīta 1985. gada rakstā, ko uzrakstīja Smits un citi, ar nosaukumu "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Tā tika izstrādāta, lai risinātu esošo metožu ierobežojumus, jo īpaši traucējumus no dažādām ķīmiskām vielām, kas parasti tiek izmantotas proteīnu ekstrakcijā un attīrīšanā.
Galvenā inovācija bija bicinchonīnskābes izmantošana, lai noteiktu Cu¹⁺ jonus, kas radīti, proteīnu izraisītās Cu²⁺ samazināšanas rezultātā, veidojot purpura krāsas kompleksu, ko var izmērīt spektrofotometriski. Tas nodrošināja vairākas priekšrocības:
Kopš tās ieviešanas BCA analīze ir kļuvusi par vienu no visplašāk izmantotajām proteīnu kvantificēšanas metodēm biochemijas un molekulārās bioloģijas laboratorijās visā pasaulē.
1=IF(B2<=0,"Kļūda: nederīga absorbance",IF(C2<=0,"Kļūda: nederīga paraugu masa",C2/(2*B2)))
2
3' Kur:
4' B2 satur absorbances mērījumu
5' C2 satur vēlamo paraugu masu μg
6' Formula atgriež nepieciešamo paraugu tilpumu μL
71import numpy as np
2import matplotlib.pyplot as plt
3
4def calculate_protein_concentration(absorbance, slope=2.0, intercept=0):
5 """Aprēķina proteīna koncentrāciju no absorbances, izmantojot standarta līkni."""
6 if absorbance < 0:
7 raise ValueError("Absorbance nedrīkst būt negatīva")
8 return (slope * absorbance) + intercept
9
10def calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope=2.0, intercept=0):
11 """Aprēķina nepieciešamo paraugu tilpumu, pamatojoties uz absorbanci un vēlamo masu."""
12 if sample_mass <= 0:
13 raise ValueError("Paraugu masai jābūt pozitīvai")
14
15 protein_concentration = calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if protein_concentration <= 0:
18 raise ValueError("Aprēķinātai proteīna koncentrācijai jābūt pozitīvai")
19
20 return sample_mass / protein_concentration
21
22# Piemēra lietošana
23absorbance = 0.75
24sample_mass = 20 # μg
25slope = 2.0
26intercept = 0
27
28try:
29 volume = calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
30 print(f"Absorbance {absorbance} un vēlamā proteīna masa {sample_mass} μg:")
31 print(f"Proteīna koncentrācija: {calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept):.2f} μg/μL")
32 print(f"Nepieciešamais paraugu tilpums: {volume:.2f} μL")
33except ValueError as e:
34 print(f"Kļūda: {e}")
351# Funkcija, lai aprēķinātu proteīna koncentrāciju no absorbances
2calculate_protein_concentration <- function(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
3 if (absorbance < 0) {
4 stop("Absorbance nedrīkst būt negatīva")
5 }
6 return((slope * absorbance) + intercept)
7}
8
9# Funkcija, lai aprēķinātu paraugu tilpumu
10calculate_sample_volume <- function(absorbance, sample_mass, slope = 2.0, intercept = 0) {
11 if (sample_mass <= 0) {
12 stop("Paraugu masai jābūt pozitīvai")
13 }
14
15 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
16
17 if (protein_concentration <= 0) {
18 stop("Aprēķinātai proteīna koncentrācijai jābūt pozitīvai")
19 }
20
21 return(sample_mass / protein_concentration)
22}
23
24# Piemēra lietošana
25absorbance <- 0.75
26sample_mass <- 20 # μg
27slope <- 2.0
28intercept <- 0
29
30tryCatch({
31 volume <- calculate_sample_volume(absorbance, sample_mass, slope, intercept)
32 protein_concentration <- calculate_protein_concentration(absorbance, slope, intercept)
33
34 cat(sprintf("Absorbance %.2f un vēlamā proteīna masa %.2f μg:\n", absorbance, sample_mass))
35 cat(sprintf("Proteīna koncentrācija: %.2f μg/μL\n", protein_concentration))
36 cat(sprintf("Nepieciešamais paraugu tilpums: %.2f μL\n", volume))
37}, error = function(e) {
38 cat(sprintf("Kļūda: %s\n", e$message))
39})
401function calculateProteinConcentration(absorbance, slope = 2.0, intercept = 0) {
2 if (absorbance < 0) {
3 throw new Error("Absorbance nedrīkst būt negatīva");
4 }
5 return (slope * absorbance) + intercept;
6}
7
8function calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope = 2.0, intercept = 0) {
9 if (sampleMass <= 0) {
10 throw new Error("Paraugu masai jābūt pozitīvai");
11 }
12
13 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
14
15 if (proteinConcentration <= 0) {
16 throw new Error("Aprēķinātai proteīna koncentrācijai jābūt pozitīvai");
17 }
18
19 return sampleMass / proteinConcentration;
20}
21
22// Piemēra lietošana
23try {
24 const absorbance = 0.75;
25 const sampleMass = 20; // μg
26 const slope = 2.0;
27 const intercept = 0;
28
29 const proteinConcentration = calculateProteinConcentration(absorbance, slope, intercept);
30 const volume = calculateSampleVolume(absorbance, sampleMass, slope, intercept);
31
32 console.log(`Absorbance ${absorbance} un vēlamā proteīna masa ${sampleMass} μg:`);
33 console.log(`Proteīna koncentrācija: ${proteinConcentration.toFixed(2)} μg/μL`);
34 console.log(`Nepieciešamais paraugu tilpums: ${volume.toFixed(2)} μL`);
35} catch (error) {
36 console.error(`Kļūda: ${error.message}`);
37}
38Attiecība starp absorbanci un proteīna koncentrāciju parasti ir lineāra noteiktā diapazonā. Zemāk ir vizualizācija standarta BCA līknei:
<text x="150" y="370">0.5</text>
<line x1="150" y1="350" x2="150" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="250" y="370">1.0</text>
<line x1="250" y1="350" x2="250" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="350" y="370">1.5</text>
<line x1="350" y1="350" x2="350" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="450" y="370">2.0</text>
<line x1="450" y1="350" x2="450" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="550" y="370">2.5</text>
<line x1="550" y1="350" x2="550" y2="355" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="300">1.0</text>
<line x1="45" y1="300" x2="50" y2="300" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="250">2.0</text>
<line x1="45" y1="250" x2="50" y2="250" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="200">3.0</text>
<line x1="45" y1="200" x2="50" y2="200" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="150">4.0</text>
<line x1="45" y1="150" x2="50" y2="150" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="100">5.0</text>
<line x1="45" y1="100" x2="50" y2="100" stroke="#64748b"/>
<text x="45" y="50">6.0</text>
<line x1="45" y1="50" x2="50" y2="50" stroke="#64748b"/>
Atšķirīgas proteīnu kvantificēšanas metodes ir dažādas priekšrocības un ierobežojumi. Šeit ir tas, kā BCA analīze salīdzinās ar citām kopējām metodēm:
| Metode | Jutības Diapazons | Priekšrocības | Ierobežojumi | Labāk piemērots |
|---|---|---|---|---|
| BCA Analīze | 5-2000 μg/mL | • Saderīga ar mazgāšanas līdzekļiem • Mazāka proteīnu variācija • Stabils krāsu attīstījums | • Traucē reducējošie aģenti • Ietekmē daži chelating līdzekļi | • Vispārējai proteīnu kvantificēšanai • Paraugiem, kas satur mazgāšanas līdzekļus |
| Bradford Analīze | 1-1500 μg/mL | • Ātra (2-5 min) • Maz traucējošu vielu | • Augsta proteīnu variācija • Nesaderīga ar mazgāšanas līdzekļiem | • Ātri mērījumi • Bez mazgāšanas līdzekļiem |
| Lowry Metode | 1-1500 μg/mL | • Labi izveidota • Laba jutība | • Daudzas traucējošas vielas • Daudzsoļu process | • Vēsturiska konsekvence • Tīri proteīnu paraugi |
| UV Absorbance (280 nm) | 20-3000 μg/mL | • Nedegradējoša • Ļoti ātra • Nav nepieciešamas reaģenti | • Ietekmē nukleīnskābes • Prasa tīrus paraugus | • Tīri proteīnu šķīdumi • Ātri pārbaudes attīrīšanas laikā |
| Fluorometriskā | 0.1-500 μg/mL | • Augstākā jutība • Plašs dinamiskais diapazons | • Dārgas reaģenti • Prasa fluorometru | • Ļoti atšķaidīti paraugi • Ierobežots paraugu tilpums |
BCA (bicinchonīnskābes) analīze galvenokārt tiek izmantota, lai kvantificētu kopējo proteīnu koncentrāciju paraugā. Tā ir plaši izmantota biochemijā, šūnu bioloģijā un molekulārajā bioloģijā tādās lietojumprogrammās kā rietumu blotēšana, enzīmu analīzes, imunoprecipitācija un proteīnu attīrīšana.
BCA analīze parasti ir precīza 5-10% robežās, ja tā tiek veikta pareizi. Tās precizitāte ir atkarīga no vairākiem faktoriem, tostarp standarta līknes kvalitātes, traucējošu vielu neesamības un vai nezināmā proteīna sastāvs ir līdzīgs izmantotā standarta proteīna sastāvam.
Daudzas vielas var traucēt BCA analīzes rezultātus, tostarp:
Galvenās atšķirības ir:
Ja jūsu kalkulators rāda ļoti lielu paraugu tilpumu, tas parasti norāda uz zemu proteīna koncentrāciju jūsu paraugā. Tas var būt saistīts ar:
Apsveriet savu paraugu koncentrēšanu vai pielāgojiet eksperimentālo dizainu, lai ņemtu vērā zemākus proteīna koncentrācijas līmeņus.
Šis kalkulators ir īpaši izstrādāts BCA analīzes rezultātiem. Lai gan pamatprincips (koncentrācijas pārvēršana tilpumā) attiecas uz citām metodēm, attiecība starp absorbanci un proteīna koncentrāciju atšķiras starp dažādām analīzēm. Citām metodēm, piemēram, Bradford vai Lowry, jums būtu jāizmanto dažādas standarta līknes parametri.
Ja absorbances mērījumi ir ārpus lineārā diapazona (parasti >2.0):
Govs serumā albumīns (BSA) ir visbiežāk izmantotais standarts BCA analīzēm, jo tas ir:
Tomēr, ja jūsu paraugos ir dominējošs proteīns, kas būtiski atšķiras no BSA, apsveriet iespēju izmantot šo proteīnu kā savu standartu, lai iegūtu precīzākus rezultātus.
Purpura krāsa, kas attīstās BCA reakcijā, ir stabila vairākas stundas istabas temperatūrā un to var izmērīt jebkurā laikā šajā periodā. Tomēr labākajiem rezultātiem ieteicams izmērīt visus standartus un paraugus apmēram tajā pašā laikā pēc krāsu attīstības.
Lai gan tehniski ir iespējams atkārtoti izmantot standarta līkni, tas nav ieteicams precīzai kvantificēšanai. Atšķirības reaģentos, inkubācijas apstākļos un instrumenta kalibrācijā var ietekmēt attiecību starp absorbanci un proteīna koncentrāciju. Lai iegūtu uzticamus rezultātus, katru reizi, kad veicat analīzi, izveidojiet jaunu standarta līkni.
Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, et al. "Measurement of protein using bicinchoninic acid." Analytical Biochemistry. 1985;150(1):76-85. doi:10.1016/0003-2697(85)90442-7
Thermo Scientific. "Pierce BCA Protein Assay Kit." Norādījumi. Pieejams: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FMAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf
Walker JM. "The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation." In: Walker JM, ed. The Protein Protocols Handbook. Springer; 2009:11-15. doi:10.1007/978-1-59745-198-7_3
Olson BJ, Markwell J. "Assays for determination of protein concentration." Current Protocols in Protein Science. 2007;Chapter 3:Unit 3.4. doi:10.1002/0471140864.ps0304s48
Noble JE, Bailey MJ. "Quantitation of protein." Methods in Enzymology. 2009;463:73-95. doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1
Tagad, kad jūs saprotat principus, kas stāv aiz BCA proteīnu kvantificēšanas un paraugu tilpuma aprēķināšanas, izmēģiniet mūsu kalkulatoru, lai vienkāršotu savu laboratorijas darba plūsmu. Vienkārši ievadiet absorbances mērījumus un vēlamo paraugu masu, lai iegūtu tūlītējus, precīzus paraugu tilpuma aprēķinus.
Neatkarīgi no tā, vai gatavojat paraugus rietumu blotēšanai, enzīmu analīzēm vai jebkurai citai proteīnu bāzētai eksperimentēšanai, mūsu kalkulators palīdzēs nodrošināt konsekventus un uzticamus rezultātus. Ietaupiet laiku, samaziniet kļūdas un uzlabojiet savu eksperimentu reproducējamību ar BCA Absorbance Paraugu Tilpuma Kalkulatoru.
Atklājiet vairāk rīku, kas varētu būt noderīgi jūsu darbplūsmai