Proteïne Oplosbaarheid Calculator - Gratis pH & Temperatuur Tool

Een calculator voor eiwitoplosbaarheid schat de hoogste concentratie van een eiwit die bij een bepaalde pH, temperatuur en ionsterkte opgelost blijft in een oplosmiddel. Het zet basische chemie om in één getal, in milligram eiwit per milliliter oplosmiddel.

Eiwitoplosbaarheid is van belang in de biochemie, geneesmiddelformulering en voedingswetenschap. Een eiwit dat niet opgelost blijft, vormt aggregaten of neerslagen, waardoor een experiment kan mislukken of een geneesmiddel niet geïnjecteerd kan worden.

Hoe eiwitoplosbaarheid wordt berekend

De oplosbaarheid hangt af van vijf zaken: het iso-elektrisch punt van het eiwit (de pH waarbij de nettolading nul is), het smeltpunt (de temperatuur waarbij het begint te ontvouwen), de diëlektrische constante van het oplosmiddel (een maat voor hoe goed het geladen deeltjes van elkaar scheidt), de pH van de oplossing en de ionsterkte (een maat voor de hoeveelheid opgelost zout).

De calculator gaat uit van de bekende oplosbaarheid van elk eiwit in water onder een vaste reeks referentieomstandigheden: 25 °C, pH 7,0 en een ionsterkte van 0,15 M (ongeveer het zoutgehalte van bloed). Vervolgens vermenigvuldigt hij die referentiewaarde met vier verhoudingen, één voor elke veranderde omstandigheid.

Formule voor eiwitoplosbaarheid

$S = S_{ref} \times \frac{f_{pH}(pH)}{f_{pH}(7.0)} \times \frac{f_{ionic}(I)}{f_{ionic}(0.15)} \times \frac{f_{temp}(T)}{f_{temp}(25)} \times f_{solvent}(\varepsilon)$

• $S_{ref}$ is de bekende oplosbaarheid van het eiwit in water onder de referentieomstandigheden, in mg/mL.
• $f_{pH}(pH) = 1 + 9\left(1 - e^{-|pH - pI|}\right)$, waarbij $pI$ het iso-elektrisch punt van het eiwit is. De oplosbaarheid is het laagst bij het iso-elektrisch punt en neemt toe naarmate de pH ervan afwijkt, waarna zij binnen enkele pH-eenheden afvlakt.
• $f_{ionic}(I) = 10^{\left(\frac{0.8\sqrt{I}}{1 + 1.5\sqrt{I}} - I\right)}$, waarbij $I$ de ionsterkte in mol per liter is. Bij lage zoutgehalten verhoogt deze term de oplosbaarheid enigszins (”salting-in”). Bij hoge zoutgehalten verlaagt hij de oplosbaarheid (”salting-out”).
• $f_{temp}(T) = e^{0.01(T-25)} \times \dfrac{1}{1 + e^{(T - T_m)/3}}$, waarbij $T_m$ het smeltpunt van het eiwit in °C is. De oplosbaarheid neemt geleidelijk toe met de temperatuur en daalt vervolgens sterk zodra de temperatuur $T_m$ nadert en het eiwit begint te ontvouwen.
• $f_{solvent}(\varepsilon) = 10^{-2000\left(\frac{1}{\varepsilon^2} - \frac{1}{78.4^2}\right)}$, waarbij $\varepsilon$ de diëlektrische constante van het oplosmiddel is. Water heeft een diëlektrische constante van 78,4, dus is deze term in water gelijk aan 1. Oplosmiddelen die ladingen minder effectief scheiden dan water, zoals ethanol, verlagen de oplosbaarheid.

Door de calculator gebruikte referentiewaarden

Oplosbaarheidscategorieën

Voorbeeld: albumine in fosfaatbuffer

Bepaal de oplosbaarheid van albumine in fosfaatbuffer bij 25 °C, pH 7,4 en een ionsterkte van 0,15 M.

De referentiewaarden van albumine zijn $pI = 4.7$, $S_{ref} = 500$ mg/mL en $T_m = 63°C$. Fosfaatbuffer heeft een diëlektrische constante van 76,0.

1. pH-term: $f_{pH}(7.4) = 1 + 9(1 - e^{-2.7}) = 9.3952$. $f_{pH}(7.0) = 1 + 9(1 - e^{-2.3}) = 9.0977$. Verhouding: $9.3952 / 9.0977 = 1.0327$.
2. Ionterm: de ionsterkte (0,15 M) is gelijk aan de referentiewaarde, dus de verhouding is 1.
3. Temperatuurterm: de temperatuur (25 °C) is gelijk aan de referentiewaarde, dus de verhouding is 1.
4. Oplosmiddelterm: $f_{solvent}(76.0) = 10^{-2000(1/76.0^2 - 1/78.4^2)} = 0.9531$.

$S = 500 \times 1.0327 \times 1 \times 1 \times 0.9531 \approx 492.12\text{ mg/mL}$

De calculator geeft 492,12 mg/mL als resultaat; dit valt in de categorie ”zeer oplosbaar”.

Voorbeeld: lysozym in glycerol bij lage temperatuur

Bepaal de oplosbaarheid van lysozym in een glyceroloplossing bij 4 °C, pH 5,0 en een ionsterkte van 0,1 M. Dit zijn omstandigheden die vergelijkbaar zijn met koude opslag van een enzym.

De referentiewaarden van lysozym zijn $pI = 11.35$, $S_{ref} = 250$ mg/mL en $T_m = 72°C$. Glycerol heeft een diëlektrische constante van 42,5.

1. pH-term: de overgang van pH 7,0 naar pH 5,0 (beide ver onder het pI van 11,35) verandert de pH-term slechts weinig. Verhouding: $9.9843 / 9.8838 = 1.0102$.
2. Ionterm: een verlaging van de ionsterkte van 0,15 M naar 0,1 M verhoogt de oplosbaarheid enigszins door het salting-in-effect. Verhouding: $1.1793 / 1.1117 = 1.0607$.
3. Temperatuurterm: afkoeling van 25 °C naar 4 °C, ruim onder het smeltpunt, verlaagt de term. Verhouding: US$ 0,8106$.
4. Oplosmiddelterm: $f_{solvent}(42.5) = 10^{-2000(1/42.5^2 - 1/78.4^2)} = 0.1652$.

$S = 250 \times 1.0102 \times 1.0607 \times 0.8106 \times 0.1652 \approx 35.88\text{ mg/mL}$

De calculator geeft 35,88 mg/mL als resultaat; dit valt in de categorie ”oplosbaar”. De lage diëlektrische constante van glycerol, niet de lage temperatuur, verlaagt het resultaat ten opzichte van de referentiewaarde.

Hoe de calculator voor eiwitoplosbaarheid wordt gebruikt

1. Kies een eiwit uit de lijst: albumine, insuline, lysozym, hemoglobine, myoglobine, collageen, caseïne of fibrinogeen.
2. Kies een oplosmiddel: water, fosfaatbuffer, Tris-buffer, glycerol, DMSO, methanol, ethanol of aceton.
3. Voer de temperatuur in °C in (0 tot 100), de pH (0 tot 14) en de ionsterkte in molair (0 tot 2).
4. Lees de berekende oplosbaarheid in mg/mL en de bijbehorende categorie af. Een balk onder het resultaat toont de waarde op een schaal van 0 tot 100 mg/mL en is volledig gevuld bij 100 mg/mL of meer.

Factoren die de eiwitoplosbaarheid beïnvloeden

pH en het iso-elektrisch punt. Elk eiwit heeft een iso-elektrisch punt, de pH waarbij het oppervlak geen nettolading draagt. Bij die pH stoten eiwitmoleculen elkaar niet af, waardoor ze gemakkelijker samenklonteren en uit de oplossing neerslaan. Als de pH in een van beide richtingen van het iso-elektrisch punt afwijkt, krijgt het eiwit een nettolading. Geladen moleculen stoten elkaar af, waardoor ze gescheiden en opgelost blijven.

Ionsterkte. Opgeloste zoutionen omringen de geladen oppervlakgroepen van een eiwit. Bij lage tot matige concentraties schermen deze ionen ladingen af die anders twee eiwitmoleculen naar elkaar toe zouden trekken, waardoor de oplosbaarheid toeneemt. Dit heet salting-in. Bij hoge zoutconcentraties concurreren ionen met het eiwit om watermoleculen, waardoor de waterlaag die het eiwit opgelost houdt wordt verwijderd. Dit heet salting-out en vormt de basis van een gebruikelijke zuiveringsmethode waarbij ammoniumsulfaat wordt gebruikt om eiwitten uit een mengsel neer te slaan.

Temperatuur. Het verwarmen van een oplossing verhoogt de oplosbaarheid doorgaans tot op zekere hoogte. Zodra de temperatuur het smeltpunt van een eiwit nadert, begint het eiwit zich te ontvouwen. Door het ontvouwen komen hydrofobe (waterafstotende) delen van het eiwit bloot te liggen die normaal verborgen zijn in de gevouwen structuur. Deze blootgelegde delen hechten aan elkaar, waardoor aggregatie ontstaat en de oplosbaarheid nabij en boven het smeltpunt sterk afneemt.

Oplosmiddel. De diëlektrische constante van een oplosmiddel is een maat voor hoe effectief het de elektrische aantrekkingskracht tussen geladen deeltjes verzwakt. Water heeft een hoge diëlektrische constante en scheidt ladingen goed, waardoor de meeste eiwitten beter oplossen in water dan in organische oplosmiddelen zoals ethanol of aceton. Oplosmiddelen met een lage diëlektrische constante laten tegengestelde ladingen op verschillende eiwitmoleculen elkaar sterker aantrekken, wat aggregatie bevordert.

Beperkingen

De calculator gebruikt een vereenvoudigd model dat is gebaseerd op een kleine reeks referentie-eiwitten en standaardoplosmiddelen. Er wordt geen rekening gehouden met de zuiverheid van het eiwit, additieven zoals detergenten of stabilisatoren, of ongebruikelijke buffercomponenten. De resultaten zijn schattingen voor het plannen van experimenten en geen vervanging voor het rechtstreeks meten van de oplosbaarheid in het laboratorium.

Veelgestelde vragen

Wat is eiwitoplosbaarheid? Eiwitoplosbaarheid is de maximale concentratie van een eiwit die volledig opgelost blijft in een oplosmiddel, zonder zichtbare aggregaten of neerslag te vormen.

Waarom is een eiwit het minst oplosbaar bij zijn iso-elektrisch punt? Bij het iso-elektrisch punt draagt het eiwit geen nettolading, waardoor eiwitmoleculen elkaar niet langer elektrisch afstoten. Zonder die afstoting zullen ze eerder aan elkaar blijven kleven en uit de oplossing neerslaan.

Wat is het verschil tussen salting-in en salting-out? Salting-in treedt op bij lage zoutconcentraties, waarbij opgeloste ionen de geladen groepen van het eiwit van elkaar afschermen en de oplosbaarheid verhogen. Salting-out treedt op bij hoge zoutconcentraties, waarbij ionen water aan het oppervlak van het eiwit onttrekken en de oplosbaarheid verlagen.

Verhoogt een hogere temperatuur altijd de oplosbaarheid? Nee. De oplosbaarheid neemt doorgaans slechts tot op zekere hoogte toe met de temperatuur. Zodra de temperatuur het smeltpunt van een eiwit nadert, begint het eiwit zich te ontvouwen, wat meestal aggregatie en een sterke daling van de oplosbaarheid veroorzaakt.

Waarom lossen eiwitten minder goed op in ethanol of aceton dan in water? Water heeft een hoge diëlektrische constante, wat betekent dat het de elektrische aantrekkingskracht tussen geladen delen van eiwitmoleculen zeer effectief verzwakt. Ethanol en aceton hebben lagere diëlektrische constanten, waardoor geladen groepen op verschillende eiwitmoleculen elkaar in deze oplosmiddelen sterker aantrekken en aggregatie waarschijnlijker wordt.

Hoe nauwkeurig is deze calculator? De calculator geeft een schatting op basis van een fysisch model en een kleine reeks referentie-eiwitten en -oplosmiddelen. Hij is nuttig om de te testen omstandigheden te beperken, maar experimentele meting blijft de enige manier om de oplosbaarheid voor een specifiek eiwitmonster te bevestigen.

Verder lezen

• Arakawa, T., & Timasheff, S. N. (1984). Mechanism of protein salting in and salting out by divalent cation salts. Biochemistry, 23(25), 5912–5923.
• Trevino, S. R., Scholtz, J. M., & Pace, C. N. (2008). Measuring and increasing protein solubility. Journal of Pharmaceutical Sciences, 97(10), 4155–4166.
• Cohn, E. J., & Edsall, J. T. (1943). Proteins, Amino Acids and Peptides as Ions and Dipolar Ions. Reinhold Publishing.