Proteïne Concentratie Calculator | A280 naar mg/mL

Eiwitconcentratiecalculator

Een eiwitconcentratiecalculator zet een meting van lichtabsorptie door een spectrofotometer om in de hoeveelheid eiwit die in een oplossing is opgelost. Het resultaat wordt meestal gegeven in milligram per milliliter (mg/mL) of microgram per milliliter (μg/mL). De berekening is gebaseerd op de wet van Beer-Lambert, een verband in de chemie dat koppelt hoeveel licht een monster absorbeert aan de hoeveelheid van een stof die het bevat.

Hoe de eiwitconcentratie wordt gemeten

De meeste eiwitten absorberen ultraviolet licht sterk bij een golflengte van 280 nanometer (nm). Deze absorptie komt voornamelijk van twee aminozuren, tryptofaan en tyrosine, die in de structuur van het eiwit voorkomen. Een spectrofotometer laat licht door het monster schijnen en meet hoeveel daarvan door het monster wordt geabsorbeerd. Deze meting wordt absorbantie genoemd, of A280 wanneer de meting bij 280 nm wordt uitgevoerd.

Absorbantie meten bij 280 nm is snel en vernietigt het monster niet. Daarmee verschilt deze methode van chemische methoden zoals de Bradford- of BCA-assay, die hieronder worden beschreven. De methode werkt het best met een gezuiverd eiwit in oplossing, met een absorbantie tussen ongeveer 0,1 en 1,0. Metingen buiten dat bereik zijn minder betrouwbaar, dus een monster moet vóór de meting vaak worden verdund.

Formule voor de eiwitconcentratie

De calculator herschrijft de wet van Beer-Lambert om de concentratie te berekenen:

C = (A × DF) / (ε × l)

• C — eiwitconcentratie, in mg/mL
• A — absorbantie bij 280 nm (een gewoon getal, zonder eenheid)
• DF — verdunningsfactor, het aantal keren dat het oorspronkelijke monster vóór de meting is verdund
• ε — extinctiecoëfficiënt, een constante die specifiek is voor het eiwit, in L/(g·cm)
• l — optische weglengte, de afstand die het licht door het monster aflegt, in cm (meestal 1 cm in een standaardcuvet, een klein glazen of plastic vat dat in de spectrofotometer wordt gebruikt)

Om het resultaat om te rekenen naar microgram per milliliter, vermenigvuldigt u de waarde in mg/mL met 1.000. Om de totale massa eiwit in het monster te vinden, vermenigvuldigt u de concentratie met het volume van het monster in milliliters.

Uitgewerkt voorbeeld

Een monster geeft een absorbantiemeting van 0,5 bij 280 nm. Het is niet verdund, dus de verdunningsfactor is 1, en het is gemeten in een standaardcuvet van 1 cm. Het eiwit is runderserumalbumine (BSA), met een extinctiecoëfficiënt van 0,667 L/(g·cm).

C = (0,5 × 1) / (0,667 × 1) ≈ 0,75 mg/mL

In een monster van 1 mL komt dat neer op ongeveer 0,75 mg totaal eiwit, of 750 μg/mL.

Extinctiecoëfficiënten voor veelvoorkomende eiwitten

Elk eiwit absorbeert licht op een andere manier, omdat elk eiwit een ander aantal tryptofaan- en tyrosineresiduen heeft. De extinctiecoëfficiënt beschrijft dit voor een specifiek eiwit bij 280 nm, in eenheden van L/(g·cm). Veelgebruikte waarden zijn onder andere:

Een calculator kan ook een aangepaste extinctiecoëfficiënt accepteren voor een eiwit dat niet in deze lijst staat. Voor een eiwit waarvan de aminozuursequentie bekend is, kan deze waarde worden geschat met een formule die Gill en von Hippel in 1989 publiceerden: ε₂₈₀ = (tryptofaanresiduen × 5.500) + (tyrosineresiduen × 1.490) + (cystineresiduen × 125). Die formule geeft een resultaat in M⁻¹cm⁻¹, een molaire eenheid die verschilt van de massagebaseerde waarden in L/(g·cm) hierboven. Gratis hulpmiddelen zoals ProtParam, die door de ExPASy-server worden aangeboden, berekenen deze waarde rechtstreeks uit een eiwitsequentie.

Optische weglengte en verdunningsfactor

De optische weglengte is de breedte van de cuvet waarin het monster zit, gemeten in centimeters. Standaardcuvetten zijn 1 cm breed. Microvolumespectrofotometers, die zeer kleine monsters meten, kunnen een veel kortere weglengte gebruiken, zoals 0,1 cm.

De verdunningsfactor houdt rekening met elke verdunning die vóór de meting is uitgevoerd. Als een geconcentreerd monster een absorbantie boven 1,0 zou geven, wordt het doorgaans eerst verdund met buffer. De verdunningsfactor is gelijk aan het totale verdunde volume gedeeld door het oorspronkelijke monstervolume. Zo geeft het mengen van 10 μL monster met 990 μL buffer een totaal volume van 1.000 μL en een verdunningsfactor van 100.

Andere manieren om de eiwitconcentratie te meten

Absorbantie bij 280 nm is een van de verschillende gangbare methoden die in een laboratorium worden gebruikt.

• Bradford-assay: gebruikt een kleurstof die van kleur verandert wanneer deze zich aan eiwit bindt. De methode werkt goed met ongezuiverde monsters, maar de kleurverandering kan verschillen tussen eiwitten.
• BCA-assay: berust op een kleurverandering die wordt veroorzaakt door de peptidebindingen van het eiwit. De methode is verenigbaar met veel detergenten, maar neemt meer tijd in beslag dan een directe absorbantiemeting.
• Lowry-methode: een oudere methode die zeer gevoelig is, maar slecht reageert met sommige veelgebruikte bufferbestanddelen.

Elk van deze drie methoden vernietigt het monster. Een directe A280-meting doet dat niet, zodat hetzelfde monster kan worden teruggewonnen en opnieuw kan worden gebruikt.

Veelgestelde vragen

Wat is het ideale absorbantiebereik voor deze methode?

Tussen 0,1 en 1,0. Onder 0,1 is de meting onnauwkeurig. Boven 1,0 is het verband tussen absorbantie en concentratie mogelijk niet langer lineair, dus moet het monster eerst worden verdund.

Waarom meten bij 280 nm in plaats van 260 nm?

Nucleïnezuren, zoals DNA en RNA, absorberen sterk bij 260 nm. Eiwitten absorberen meer bij 280 nm vanwege hun gehalte aan tryptofaan en tyrosine. Meten bij 280 nm vermindert de interferentie door eventueel aanwezige nucleïnezuren in het monster.

Hoe wordt de extinctiecoëfficiënt gevonden voor een eiwit dat niet in de lijst staat?

Voor een eiwit waarvan de sequentie bekend is, berekent een hulpmiddel zoals ProtParam de coëfficiënt aan de hand van het aantal tryptofaan-, tyrosine- en cystineresiduen. De coëfficiënt kan ook rechtstreeks worden gemeten door de absorbantie van het monster te vergelijken met die van een oplossing met bekende concentratie.

Werkt deze methode voor een mengsel van eiwitten?

De methode werkt het best voor één gezuiverd eiwit met een bekende extinctiecoëfficiënt. Een mengsel van onbekende eiwitten, zoals een cellysaat, wordt doorgaans gemeten met de Bradford- of BCA-assay, omdat die methoden een consistentere schatting van de totale hoeveelheid eiwit geven.

Kunnen detergenten de meting verstoren?

Ja. Veel detergenten absorberen licht in de buurt van 280 nm, waardoor het resultaat kan worden vertekend. Een blanco monster met dezelfde detergentconcentratie helpt die achtergrondabsorptie te compenseren. Bij zeer hoge detergentconcentraties kan een detergentcompatibele assay, zoals BCA, nodig zijn.