Cellefortynningsberegner - Nøyaktig laboratorieverktøy for fortynning

Kalkulator for cellefortynning

En kalkulator for cellefortynning finner ut hvor mye cellesuspensjon og hvor mye fortynningsvæske som skal blandes for å oppnå en ønsket cellekonsentrasjon i et valgt sluttvolum. Den brukes i cellekultur, mikrobiologi og annet laboratoriearbeid der en prøve må bringes til en nøyaktig konsentrasjon før bruk.

Hva cellefortynning betyr

Fortynning av en cellesuspensjon endrer ikke hvor mange celler den inneholder. Den endrer bare volumet cellene befinner seg i, noe som senker konsentrasjonen. En suspensjon målt til 1 000 000 celler per milliliter (celler/mL) inneholder fortsatt det samme totale antallet celler etter fortynning. Antallet er ganske enkelt fordelt i mer væske.

Laboratorier fortynner celler før mange rutinemessige trinn: deling av en voksende kultur i nye kolber, utsåing av et bestemt antall celler i hver brønn i en plate, nedfrysing av celler for lagring eller klargjøring av en prøve for en celleteller eller et flowcytometer.

Formel for cellefortynning

Beregningen bygger på én regel. Antallet celler som tas fra stamsuspensjonen, multiplisert med konsentrasjonen, må være lik antallet celler i sluttvolumet, multiplisert med målkonsentrasjonen:

C₁ × V₁ = C₂ × V₂

• C₁ — startkonsentrasjon (stamkonsentrasjon), i celler/mL
• V₁ — volum av stamsuspensjon som skal brukes, i mL
• C₂ — målkonsentrasjon, i celler/mL
• V₂ — nødvendig totalt sluttvolum, i mL

Når man løser med hensyn på V₁, får man volumet av stamsuspensjon som skal pipetteres:

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁

Resten av sluttvolumet er fortynningsvæske, vanligvis cellekulturmedium, fosfatbufret saltløsning (PBS) eller en annen buffer:

Fortynningsvæskevolum = V₂ − V₁

Målkonsentrasjonen (C₂) kan aldri være høyere enn stammekonsentrasjonen (C₁). Fortynning senker bare konsentrasjonen. For å øke den må cellene sentrifugeres ned og resuspenderes i mindre væskevolum.

Slik beregner du en cellefortynning

1. Tell stamsuspensjonen med et hemocytometer eller en automatisk celleteller for å finne C₁.
2. Noter målkonsentrasjonen, C₂, som protokollen krever.
3. Bestem det nødvendige totale sluttvolumet, V₂.
4. Beregn V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁.
5. Beregn volumet av fortynningsvæske som V₂ − V₁.
6. Pipetter V₁ av stamsuspensjonen i et rør, og tilsett deretter volumet av fortynningsvæske i form av medium eller buffer.

Regneeksempel

En stamsuspensjon er målt til 1 000 000 celler/mL. En protokoll krever 100 000 celler/mL i et sluttvolum på 10 mL.

V₁ = (C₂ × V₂) ÷ C₁ = (100 000 × 10) ÷ 1 000 000 = 1 000 000 ÷ 1 000 000 = 1 mL

Volum av fortynningsvæske = V₂ − V₁ = 10 − 1 = 9 mL

Ved å ta 1 mL av stamsuspensjonen og tilsette 9 mL medium får man 10 mL suspensjon med 100 000 celler/mL.

Et annet eksempel

En analyse i en plate med 96 brønner krever 10 000 celler per brønn i 200 mikroliter (μL) medium per brønn. Det tilsvarer en målkonsentrasjon på 50 000 celler/mL, siden 10 000 celler delt på 0,2 mL er lik 50 000 celler/mL. Stamsuspensjonen er målt til 2 000 000 celler/mL, og det trengs totalt 20 mL for å dekke platen med litt ekstra på grunn av pipetteringstap.

V₁ = (50 000 × 20) ÷ 2 000 000 = 1 000 000 ÷ 2 000 000 = 0,5 mL

Volum av fortynningsvæske = 20 − 0,5 = 19,5 mL

Blanding av 0,5 mL stamsuspensjon med 19,5 mL medium gir 20 mL med 50 000 celler/mL, en fortynning på 1 til 40.

Feilkilder

Selve formelen er nøyaktig. Feilene skyldes tallene som settes inn i den.

• Tellefeil. En feil celletelling fører direkte til feil fortynning. Risikoen reduseres ved å telle alle de fire hjørnefeltene i et hemocytometergitter og beregne gjennomsnittet.
• Klumper av celler. En celleklump ser ut som én celle i mikroskopet, men består egentlig av flere celler, og senker derfor den tilsynelatende konsentrasjonen.
• Pipetteområde. En pipette som brukes utenfor det angitte volumområdet, gir unøyaktige resultater. En 1000 μL-pipette stilt inn på å dispensere 5 μL er ikke pålitelig; i stedet bør en mindre pipette brukes.
• Forveksling av enheter. Blanding av celler/mL og celler/μL gir en feil som er tusen ganger for stor eller for liten.
• Døde celler. En rå celletelling inkluderer døde celler med mindre det er brukt en levedyktighetsfarging, for eksempel trypanblått. Dette kan overvurdere antallet levende celler som faktisk er til stede.

Begrensninger for denne kalkulatoren

Kalkulatoren avviser tall som den ikke kan gi et nyttig svar på:

• Alle verdier må være større enn null.
• Målkonsentrasjonen kan ikke være høyere enn startkonsentrasjonen.
• Startkonsentrasjonen må være 1 billion celler/mL (1 × 10¹²) eller lavere.
• Stamvolumet som beregnes, må være minst 0,001 mL, som tilsvarer 1 mikroliter. Mindre volumer kan ikke pipetteres nøyaktig, så kalkulatoren ber om andre tall. Dette løses vanligvis ved å øke totalvolumet.

Volumer vises med to desimaler, eller med tre når stamvolumet er mindre enn 0,01 mL, slik at et lite volum aldri vises som 0,00 mL.

Ofte stilte spørsmål

Hva er formelen for cellefortynning?

C₁ × V₁ = C₂ × V₂, der C₁ og C₂ er start- og målkonsentrasjonene, og V₁ og V₂ er volumet som tas fra stamsuspensjonen og det totale sluttvolumet.

Kan målkonsentrasjonen være høyere enn startkonsentrasjonen?

Nei. Fortynning senker bare konsentrasjonen. For å oppnå en høyere konsentrasjon må cellene sentrifugeres og resuspenderes i et mindre volum.

Hvilken væske bør brukes til å fortynne celler?

Komplett kulturmedium brukes når cellene må holde seg friske i timer eller dager, for eksempel før utsåing i en plate. PBS eller en tilsvarende bufret saltløsning fungerer ved korte fortynninger, under omtrent 30 minutter, før cellene behandles videre. Serumfritt medium brukes når serumproteiner ville forstyrret en etterfølgende analyse.

Gjelder denne formelen for bakterier eller gjær?

Ja. C₁V₁ = C₂V₂ gjelder for alle suspensjoner av partikler, inkludert bakterier målt i kolonidannende enheter per milliliter (CFU/mL), gjær og viruspartikler målt i plakkdannende enheter per milliliter (PFU/mL), så lenge de samme enhetene brukes på begge sider av ligningen.

Skal døde celler tas med i fortynningen?

Ved utsåing av en levende kultur skal bare levedyktige celler telles. Hvis en suspensjon er 80 % levedyktig, er den levedyktige konsentrasjonen 0,8 ganger det totale celletallet, og denne levedyktige konsentrasjonen skal brukes som C₁.

Hvordan kan svært store fortynninger lages nøyaktig?

Store fortynninger, for eksempel 1-til-1000, gjøres vanligvis som en serie mindre trinn kalt seriefortynninger. Tre påfølgende fortynninger på 1-til-10 gir totalt 1-til-1000, samtidig som hvert pipetteringstrinn holdes innenfor et nøyaktig volumområde.