DNA Kopitallkalkulator | Genomisk Analyseverktøy

Kalkulator for DNA-kopitall

En kalkulator for DNA-kopitall anslår hvor mange kopier av en målsekvens som finnes i en DNA-prøve. Den bruker prøvens konsentrasjon, volum og hvor ofte målsekvensen forekommer i den lengre DNA-sekvensen. Laboratorier innen molekylærbiologi bruker slike estimater til å planlegge eksperimenter som qPCR (kvantitativ polymerasekjedereaksjon) før de utfører en dyrere og mer presis analyse.

Hva DNA-kopitall betyr

DNA-kopitall er antallet ganger en bestemt sekvens forekommer i et genom eller en prøve. Et typisk menneskegen forekommer i to kopier, én arvet fra hver forelder. Flere forhold kan endre dette antallet.

• Amplifikasjon: mer enn to kopier. Kreftceller amplifiserer ofte gener som driver vekst, for eksempel HER2 i enkelte brystsvulster.
• Delesjon: færre enn to kopier, noen ganger ingen. Delesjoner kan forårsake genetiske sykdommer.
• Duplisering: en ekstra kopi forekommer der det bare skulle vært én eller to.
• Kopitallsvariasjon (CNV): en normal forskjell i kopitall mellom individer, som finnes i en betydelig del av det menneskelige genomet.

Formel for DNA-kopitall

Kalkulatoren omgjør antall sekvensforekomster og prøvemasse til et kopitall ved hjelp av denne formelen:

$\text{Kopitall} = \frac{\text{Forekomster} \times \text{Konsentrasjon} \times \text{Volum} \times N_A}{\text{DNA-lengde} \times 660 \times 10^{9}}$

Der:

• Forekomster — hvor mange ganger målsekvensen forekommer i den fullstendige DNA-sekvensen, der overlappende treff telles separat.
• Konsentrasjon — DNA-konsentrasjon i nanogram per mikroliter (ng/μL), vanligvis målt med et spektrofotometer eller et fluorometer.
• Volum — prøvevolum i mikroliter (μL).
• $N_A$ — Avogadros tall, 6,022 × 10²³ molekyler per mol. Det omgjør stoffmengden DNA i mol til et antall molekyler.
• DNA-lengde — lengden på den fullstendige DNA-sekvensen, i basepar.
• 660 — gjennomsnittlig molekylmasse for ett DNA-basepar, i gram per mol (g/mol). Et basepar består av to parede nukleotider, ett fra hver DNA-tråd.
• 10⁹ — omgjør nanogram til gram.

Formelen omgjør først prøvens masse til stoffmengde DNA-molekyler i mol, multipliserer med Avogadros tall for å finne det totale antallet DNA-molekyler i prøven, og multipliserer deretter med antallet ganger målsekvensen forekommer i hvert molekyl.

Verktøyet godtar bare bokstavene A, T, C og G. Mellomrom og linjeskift ignoreres, og små bokstaver telles på samme måte som store bokstaver.

Slik beregnes DNA-kopitall: regneeksempel

Ta en DNA-sekvens på 12 basepar, ATCGATCGATCG, med målsekvensen ATCG, en konsentrasjon på 10 ng/μL og et volum på 20 μL.

Trinn 1: Tell forekomstene. ATCG forekommer 3 ganger i ATCGATCGATCG (i posisjonene 1, 5 og 9).

Trinn 2: Finn den totale DNA-massen. Konsentrasjon × volum = 10 × 20 = 200 ng.

Trinn 3: Omregn til mol. 200 ng = 2 × 10⁻⁷ g. Del på (12 basepar × 660 g/mol) = 7 920 g/mol. Dette gir 2,53 × 10⁻¹¹ mol.

Trinn 4: Omregn til antall molekyler. Multipliser med Avogadros tall: 2,53 × 10⁻¹¹ mol × 6,022 × 10²³ molekyler/mol ≈ 1,52 × 10¹³ DNA-molekyler.

Trinn 5: Multipliser med antallet forekomster. 3 × 1,52 × 10¹³ ≈ 4,56 × 10¹³, eller omtrent 45 621 212 121 212 kopier.

Dette tallet virker enormt fordi en prøve på 20 μL med 10 ng/μL likevel rommer billioner av korte DNA-molekyler. I virkelige prøver brukes vanligvis mye lengre sekvenser, noe som reduserer antallet molekyler for samme masse.

Bruksområder for analyse av DNA-kopitall

Kreftdiagnostikk. Patologilaboratorier undersøker kopitallet av HER2 i brystsvulstvev. En normal celle har to kopier. En amplifisert svulst kan ha seks eller flere, noe som påvirker om pasienten kan få målrettede legemidler som trastuzumab.

Testing for genetiske sykdommer. Tilstander som DiGeorge syndrom innebærer delesjon av et kromosomsegment. Downs syndrom innebærer en ekstra kopi av kromosom 21 (trisomi 21). Kopitelling bidrar til å bekrefte disse diagnosene.

Kvantifisering av transgener og plasmider. Forskere undersøker hvor mange kopier av et innsatt gen som er kommet inn i en plante-, dyre- eller bakteriecelle. Én kopi foretrekkes vanligvis, fordi flere kopier kan utløse at cellen slår av genet.

Overvåking av patogener og virusmengde. Estimater av kopitall brukes til å følge mengden viralt eller bakterielt DNA i en prøve, blant annet ved infeksjonsovervåking og miljøtesting.

Andre metoder for å måle kopitall

Denne kalkulatoren gir et raskt estimat basert på sekvens- og konsentrasjonsdata. Laboratorier som trenger større presisjon, bruker vanligvis én av disse metodene i stedet:

• Kvantitativ PCR (qPCR): amplifiserer og måler DNA i sanntid; er nøyaktig innenfor omtrent 15–20% med en god standardkurve.
• Digital PCR (dPCR): deler en prøve opp i tusenvis av små reaksjoner for direkte telling, uten behov for en standardkurve.
• Fluorescens in situ-hybridisering (FISH): teller sekvenser visuelt i mikroskop direkte i celler eller kromosomer; standardmetoden ved mange laboratorier for kreftdiagnostikk.
• Sekvensering av neste generasjon (NGS): sekvenserer hele prøven og kartlegger kopitall over hele genomet samtidig.

Ofte stilte spørsmål

Hva er DNA-kopitall? Det er antallet ganger en bestemt DNA-sekvens forekommer i et genom eller en prøve. De fleste menneskegener forekommer i to kopier, én fra hver forelder. Ekstra eller manglende kopier kan påvirke helse og risiko for sykdom.

Hvor nøyaktig er denne kalkulatoren? Den gir et teoretisk estimat basert på oppgitte verdier, ikke en laboratoriemåling. Nøyaktigheten avhenger av hvor presist konsentrasjonen ble målt, og hvor spesifikk målsekvensen er. Metoder som digital PCR er mer presise for resultater som skal publiseres.

Kan denne kalkulatoren brukes for RNA? Nei. RNA bruker uracil i stedet for tymin og et annet sukker, så molekylmassen er forskjellig fra DNA. RNA har en gjennomsnittlig molekylmasse på omtrent 330 g/mol per nukleotid, sammenlignet med omtrent 660 g/mol per DNA-basepar. Hvis DNA-formelen brukes på RNA-data, blir svaret feil.

Hvorfor telles en overlappende sekvens mer enn én gang? Kalkulatoren teller hver posisjon der målsekvensen passer, selv om treffene deler bokstaver. I ATATAT passer sekvensen ATA to ganger, i posisjon 1 og posisjon 3, fordi hver startposisjon kontrolleres uavhengig.

Hvilket område for DNA-konsentrasjon fungerer best? Konsentrasjoner på 10–100 ng/μL gir de mest pålitelige målingene med standard laboratorieinstrumenter. Under 10 ng/μL øker målefeilen, og en mer følsom metode, for eksempel et fluorometer, anbefales fremfor et standard spektrofotometer.

Kan denne kalkulatoren anslå plasmidkopitall? Ja. Skriv inn hele plasmidsekvensen som DNA-sekvens, og en unik region av innsatsen som målsekvens, sammen med den målte plasmidkonsentrasjonen og prøvevolumet.