DNA Konsentrasjonsberegner | A260 til ng/μL Konverter

DNA-konsentrasjonskalkulator

En kalkulator for DNA-konsentrasjon omdanner en UV-absorbansmåling ved 260 nanometer, kalt A260, til DNA-konsentrasjon i nanogram per mikroliter (ng/µL). Den rapporterer også den totale DNA-mengden i en prøve, i mikrogram (µg).

Hva er absorbans ved A260?

A260 er mengden ultrafiolett lys en løsning absorberer ved en bølgelengde på 260 nanometer. DNA absorberer UV-lys sterkest nær denne bølgelengden på grunn av nukleotidbasene. Et spektrofotometer måler A260 etter en blankmåling, der samme buffer som i prøven brukes til å fjerne bakgrunnsabsorbans. Jo mer DNA løsningen inneholder, desto høyere blir A260-målingen.

Formel for DNA-konsentrasjon

Dobbelttrådet DNA absorberer UV-lys proporsjonalt med konsentrasjonen, et forhold som er kjent som Beer-Lamberts lov. Ved en standard lysbane på 1 centimeter inneholder en løsning med en A260-måling på 1,0 omtrent 50 ng/µL dobbelttrådet DNA. Dette tallet, omregningsfaktoren, omgjør enhver A260-måling til en konsentrasjon:

DNA-konsentrasjon (ng/µL) = A260 × 50 × fortynningsfaktor

Fortynningsfaktoren tar hensyn til eventuell fortynning som ble utført før prøven ble målt. En prøve som måles uten fortynning, har en fortynningsfaktor på 1.

Slik beregnes den totale DNA-mengden

Når konsentrasjonen er kjent, kan den totale DNA-massen i prøven bestemmes ut fra volumet:

Total mengde DNA (µg) = konsentrasjon (ng/µL) × volum (µL) ÷ 1000

Slik beregnes DNA-konsentrasjon: trinn for trinn

1. Bland prøven grundig før måling. DNA kan feste seg til rørveggene eller synke ujevnt.
2. Fortynn prøven hvis den er svært konsentrert, med sikte på en A260-måling mellom 0,1 og 1,0. Spektrofotometermålinger er minst pålitelige utenfor dette området.
3. Blank spektrofotometeret med den samme bufferen som ble brukt til fortynningen, og mål deretter prøven ved 260 nm.
4. Angi A260-målingen, prøvevolumet og fortynningsfaktoren i kalkulatoren for å få konsentrasjonen og den totale DNA-mengden. Alle de tre feltene må fylles ut, og volumet må være større enn null, før et resultat vises.

Regneeksempel

Eksempel 1: ufortynnet prøve

En A260-måling på 0,5, ingen fortynning (fortynningsfaktor 1) og et prøvevolum på 100 µL.

• Konsentrasjon = 0,5 × 50 × 1 = 25 ng/µL
• Totalt DNA = 25 × 100 ÷ 1000 = 2,5 µg

Eksempel 2: fortynnet prøve

Et rør inneholder 50 µL renset DNA. En liten del av det ble fortynnet 10 ganger, og den fortynnede delen ga en A260-måling på 0,75. Fortynningsfaktoren omregner denne målingen tilbake til konsentrasjonen i det opprinnelige røret, og 50 µL er volumet som angis i trinnet for beregning av total mengde.

• Konsentrasjon = 0,75 × 50 × 10 = 375 ng/µL
• Totalt DNA = 375 × 50 ÷ 1000 = 18,75 µg

Beregning av fortynningsfaktoren

Fortynningsfaktor = totalt volum etter fortynning ÷ volumet av den opprinnelige prøven.

Når 5 µL DNA-løsning tilsettes 45 µL buffer, blir totalvolumet 50 µL, og fortynningsfaktoren er 50 ÷ 5 = 10. En prøve som ikke er fortynnet, har en fortynningsfaktor på 1.

Typiske områder for DNA-konsentrasjon

Konsentrasjonen avhenger av prøvetypen og ekstraksjonsmetoden. Ekstrakter av genomisk DNA ligger vanligvis mellom omtrent 10 og 100 ng/µL. Plasmid-DNA-preparater gir ofte høyere konsentrasjoner, noen ganger flere hundre ng/µL. Et resultat som ligger langt utenfor det forventede området for en bestemt metode, kan tyde på et problem med selve ekstraksjonen eller målingen.

Begrensninger ved UV-absorbansmåling

Måling av A260 går raskt, men er ikke den mest følsomme eller spesifikke metoden for DNA. Proteiner, RNA og enkelte bufferkomponenter absorberer også lys nær 260 nm og kan gi en for høy måling. Forskere kontrollerer ofte A260/A280-forholdet sammen med konsentrasjonen for å undersøke proteinforurensning; et forhold nær 1,8 tyder vanligvis på en ren DNA-prøve. Metoder basert på fluorescerende fargestoffer, for eksempel Qubit-analyser, binder bare dobbelttrådet DNA og gir en mer nøyaktig måling for fortynnede eller urene prøver, men krever ekstra reagenser og et fluorometer.

Ofte stilte spørsmål

Hvordan beregner man DNA-konsentrasjon fra A260?

Multipliser A260-målingen med 50, standardomregningsfaktoren for dobbelttrådet DNA, og multipliser deretter med fortynningsfaktoren. Hvis prøven ikke ble fortynnet, bruker du en fortynningsfaktor på 1.

Hva er et godt A260/A280-forhold?

Et forhold nær 1,8 tyder vanligvis på en ren DNA-prøve. Et lavere forhold tyder på proteinforurensning. Et forhold over 2,0 kan tyde på RNA-forurensning.

Kan denne kalkulatoren brukes for RNA?

Ikke direkte, fordi RNA bruker en omregningsfaktor på 40 ng/µL i stedet for 50. For å anslå RNA-konsentrasjonen multipliserer du kalkulatorens resultat med 0,8 (40 ÷ 50), eller bruker A260 × 40 × fortynningsfaktor direkte.

Hvorfor bør A260-målingen ligge mellom 0,1 og 1,0?

Absorbansen er omtrent proporsjonal med konsentrasjonen, slik Beer-Lamberts lov beskriver, hovedsakelig innenfor dette området. Utenfor området blir målingene mindre pålitelige, så en prøve som er for konsentrert eller for fortynnet, bør fortynnes eller konsentreres før den måles på nytt.

Hva er forskjellen mellom konsentrasjon og renhet?

Konsentrasjon angir hvor mye DNA som finnes, i ng/µL. Renhet angir hvor ren prøven er, hovedsakelig vurdert ut fra absorbansforhold som A260/A280. En prøve kan ha høy konsentrasjon og likevel være uren, eller ha lav konsentrasjon og være svært ren.

Hvordan omregner jeg ng/µL til µg/mL?

De to enhetene er numerisk like. 1 ng/µL er lik 1 µg/mL, fordi både masseenheten og volumenheten skaleres med en faktor på 1000.

Referanser

1. Sambrook, J., & Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
2. Gallagher, S. R., & Desjardins, P. R. (2006). Quantitation of DNA and RNA with absorption and fluorescence spectroscopy. Current Protocols in Molecular Biology, 76(1), A-3D.
3. Manchester, K. L. (1995). Value of A260/A280 ratios for measurement of purity of nucleic acids. BioTechniques, 19(2), 208–210.