DNA Ligasjon Kalkulator - Beregn Innsats:Vektor Forhold for Molekylær Kloning

DNA-ligering er trinnet i molekylær kloning der et insertfragment ligeres inn i en plasmidvektor ved hjelp av enzymet T4-DNA-ligase. En kalkulator for DNA-ligering beregner hvilke volumer av insert-DNA og vektor-DNA som skal blandes, slik at reaksjonen oppnår et valgt molart forhold mellom insert og vektor.

Hva kalkulatoren gjør

Kalkulatoren tar imot seks inndata: vektorkonsentrasjon, vektorlengde, insertkonsentrasjon, insertlengde, ønsket molart forhold mellom insert og vektor samt totalt reaksjonsvolum. Den lar også brukeren angi hvor mye vektor-DNA som skal brukes, med standardverdien 50 nanogram (ng). Ut fra disse verdiene beregner den volumet av vektor som skal pipetteres, volumet av insert som skal pipetteres og hvor mye buffer eller vann som skal tilsettes for å nå det totale reaksjonsvolumet.

Konsentrasjon måles i nanogram per mikroliter (ng/μL), vanligvis avlest med et Nanodrop- eller Qubit-instrument. Lengde måles i basepar (bp). Én kilobase (kb) tilsvarer 1000 basepar. Det molare forholdet beskriver hvor mange insertmolekyler som skal være til stede for hvert vektormolekyl. Det er ikke et masseforhold.

Hvorfor molart forhold, ikke masse, brukes

Like masser av DNA inneholder ikke like mange molekyler. Et kort insert veier mindre enn en lang vektor med samme antall molekyler. Hvis like mengder i nanogram av et kort insert og en lang vektor blandes, blir det altfor få insertmolekyler i forhold til vektormolekylene. Kalkulatoren skalerer insertmassen etter forholdet mellom fragmentlengdene, slik at den ferdige blandingen får ønsket antall insertmolekyler per vektormolekyl.

Formel for DNA-ligering

Mengden insert-DNA som trengs, i nanogram, er:

$m_i = m_v \times \frac{k_i}{k_v} \times R$

der $m_i$ er mengden insert i nanogram, $m_v$ mengden vektor i nanogram, $k_i$ insertlengden i kilobaser, $k_v$ vektorlengden i kilobaser, og R det ønskede molare forholdet mellom insert og vektor.

Når denne mengden er kjent, konverterer kalkulatoren hver mengde til et volum som kan pipetteres:

$V_v = \frac{m_v}{c_v}$

$V_i = \frac{m_i}{c_i}$

$V_b = V_t - V_v - V_i$

der $V_v$ og $V_i$ er vektor- og insertvolumene i mikroliter, $c_v$ og $c_i$ er vektor- og insertkonsentrasjonene i nanogram per mikroliter, $V_b$ er buffervolumet, og $V_t$ det totale reaksjonsvolumet.

Hvis vektor- og insertvolumene til sammen er større enn det totale reaksjonsvolumet, er det ikke plass igjen til buffer, ligase eller vann. I så fall rapporterer kalkulatoren at totalvolumet er for lite, i stedet for å vise en negativ buffermengde.

Regneeksempel

En forsker kloner et 1 kb genfragment inn i en 3 kb plasmidvektor. Planen er å bruke 50 ng vektor-DNA ved et 3:1 molart forhold mellom insert og vektor, i en reaksjon på 20 μL.

Inndata:

• Vektorkonsentrasjon: 50 ng/μL
• Vektorlengde: 3000 bp (3 kb)
• Insertkonsentrasjon: 25 ng/μL
• Insertlengde: 1000 bp (1 kb)
• Molart forhold: 3
• Totalt volum: 20 μL
• Vektormengde: 50 ng

Trinn 1: insertmengde

ng insert = 50 × (1 ÷ 3) × 3 = 50 ng

Trinn 2: volumer

Vektorvolum = 50 ng ÷ 50 ng/μL = 1 μL

Insertvolum = 50 ng ÷ 25 ng/μL = 2 μL

Buffervolum = 20 − 1 − 2 = 17 μL

Reaksjonen består av 1 μL vektor, 2 μL insert og 17 μL buffer eller vann, som også er der ligasen og reaksjonsbufferen tilsettes. Denne blandingen gir tre insertmolekyler per vektormolekyl.

Typiske molare forhold ved ligering

Ved de fleste standardkloninger med klebrige, overhengende ender brukes et 3:1-forhold mellom insert og vektor. Ligeringer der butte ender sammenføyes, er mindre effektive, så et høyere forhold, for eksempel 5:1, er vanlig. Svært store inserter fungerer noen ganger bedre med et lavere forhold, nærmere 1:1, siden store fragmenter allerede bidrar med mange basepar per molekyl.

Ofte stilte spørsmål

Hva er DNA-ligering?

DNA-ligering er sammenføyningen av to DNA-fragmenter, vanligvis bestående av en plasmidvektor og et insert, til ett sammenhengende molekyl. Enzymet T4-DNA-ligase forsegler forbindelsen mellom endene av fragmentene.

Hva betyr det molare forholdet mellom insert og vektor?

Det angir hvor mange insert-DNA-molekyler som finnes per vektormolekyl i reaksjonen. Et 3:1-forhold betyr tre insertmolekyler per vektormolekyl, uavhengig av hvordan massene deres sammenlignes.

Hvorfor brukes ikke like mengder vektor og insert i nanogram?

DNA-fragmenter med ulik lengde har ulik masse per molekyl. Et insert på 1 kb veier omtrent en tredjedel så mye som en vektor på 3 kb, molekyl for molekyl. Like mengder i nanogram av hver ville ikke gi like mange molekyler, så kalkulatoren justerer insertmassen slik at det ønskede molare forholdet oppnås.

Hva betyr det hvis totalvolumet er for lite?

Det betyr at vektor- og insertvolumene alene allerede opptar hele reaksjonsvolumet, slik at det ikke er plass for buffer eller ligase. Løsningen er å øke det totale reaksjonsvolumet eller bruke mer konsentrerte DNA-lagre.

Kan denne kalkulatoren brukes til Gibson Assembly- eller Golden Gate-kloning?

Nei. Disse metodene bruker en annen reaksjonskjemi og sikter vanligvis mot ekvimolare mengder av alle fragmentene, ikke et fast forhold mellom insert og vektor. Volumberegningene deres skiller seg fra vanlig T4-ligasekloning.

Hvor mye vektor-DNA brukes vanligvis?

50 ng er en vanlig startmengde i en standard ligeringsreaksjon. Laboratorier bruker også mengder fra 25 til 100 ng, justert etter DNA-konsentrasjonen og reaksjonens skala.