Kalkulator Stężenia Białka | A280 do mg/mL

Kalkulator stężenia białka

Kalkulator stężenia białka przelicza odczyt absorbancji światła ze spektrofotometru na ilość białka rozpuszczonego w roztworze. Wynik jest zwykle podawany w miligramach na mililitr (mg/mL) lub mikrogramach na mililitr (μg/mL). Obliczenia opierają się na prawie Beera-Lamberta, zależności stosowanej w chemii, która łączy ilość światła pochłanianego przez próbkę z ilością zawartej w niej substancji.

Jak mierzy się stężenie białka

Większość białek silnie pochłania światło ultrafioletowe przy długości fali 280 nanometrów (nm). Za tę absorpcję odpowiadają głównie dwa aminokwasy — tryptofan i tyrozyna — obecne w strukturze białka. Spektrofotometr przepuszcza światło przez próbkę i mierzy, jaka jego ilość jest przez nią pochłaniana. Odczyt ten nazywa się absorbancją lub A280, gdy pomiar wykonano przy 280 nm.

Pomiar absorbancji przy 280 nm jest szybki i nie niszczy próbki. Od tej metody różnią się metody chemiczne, takie jak test Bradforda lub test BCA, opisane poniżej. Metoda najlepiej sprawdza się w przypadku oczyszczonego białka w roztworze, którego absorbancja wynosi od około 0,1 do 1,0. Odczyty spoza tego zakresu są mniej wiarygodne, dlatego przed pomiarem próbkę często trzeba rozcieńczyć.

Wzór na stężenie białka

Kalkulator przekształca prawo Beera-Lamberta, aby obliczyć stężenie:

C = (A × DF) / (ε × l)

• C — stężenie białka w mg/mL
• A — absorbancja przy 280 nm (zwykła liczba, bez jednostki)
• DF — współczynnik rozcieńczenia, czyli ile razy rozcieńczono próbkę wyjściową przed pomiarem
• ε — współczynnik ekstynkcji, stała właściwa dla danego białka, w L/(g·cm)
• l — długość drogi optycznej, czyli odległość, jaką światło przebywa w próbce, w cm (zwykle 1 cm w standardowej kuwecie, małym szklanym lub plastikowym pojemniku używanym w spektrofotometrze)

Aby przeliczyć wynik na mikrogramy na mililitr, należy pomnożyć wartość w mg/mL przez 1 000. Aby obliczyć całkowitą masę białka w próbce, należy pomnożyć stężenie przez objętość próbki w mililitrach.

Przykład rozwiązany

Próbka daje odczyt absorbancji 0,5 przy 280 nm. Nie została rozcieńczona, więc współczynnik rozcieńczenia wynosi 1, a pomiar wykonano w standardowej kuwecie o długości drogi optycznej 1 cm. Białkiem jest albumina surowicy bydlęcej (BSA), której współczynnik ekstynkcji wynosi 0,667 L/(g·cm).

C = (0,5 × 1) / (0,667 × 1) ≈ 0,75 mg/mL

W próbce o objętości 1 mL oznacza to około 0,75 mg całkowitego białka lub 750 μg/mL.

Współczynniki ekstynkcji typowych białek

Każde białko pochłania światło inaczej, ponieważ zawiera inną liczbę reszt tryptofanu i tyrozyny. Współczynnik ekstynkcji opisuje tę właściwość dla konkretnego białka przy 280 nm, w jednostkach L/(g·cm). Często stosowane wartości to:

Kalkulator może również przyjmować niestandardowy współczynnik ekstynkcji dla białka, którego nie ma na tej liście. W przypadku białka o znanej sekwencji aminokwasowej wartość tę można oszacować za pomocą wzoru opublikowanego przez Gilla i von Hippela w 1989: ε₂₈₀ = (reszty tryptofanu × 5 500) + (reszty tyrozyny × 1 490) + (reszty cystyny × 125). Wzór ten daje wynik w M⁻¹cm⁻¹, czyli w jednostce molowej, która różni się od podanych wyżej wartości masowych w L/(g·cm). Bezpłatne narzędzia, takie jak ProtParam dostępny na serwerze ExPASy, obliczają tę wartość bezpośrednio na podstawie sekwencji białka.

Długość drogi optycznej i współczynnik rozcieńczenia

Długość drogi optycznej to szerokość kuwety zawierającej próbkę, mierzona w centymetrach. Standardowe kuwety mają szerokość 1 cm. Spektrofotometry mikroobjętościowe, które mierzą bardzo małe próbki, mogą wykorzystywać znacznie krótszą drogę optyczną, na przykład 0,1 cm.

Współczynnik rozcieńczenia uwzględnia rozcieńczenie wykonane przed pomiarem. Jeśli stężona próbka dawałaby absorbancję powyżej 1,0, często najpierw rozcieńcza się ją buforem. Współczynnik rozcieńczenia jest równy całkowitej objętości po rozcieńczeniu podzielonej przez objętość próbki wyjściowej. Na przykład zmieszanie 10 μL próbki z 990 μL buforu daje całkowitą objętość 1 000 μL i współczynnik rozcieńczenia 100.

Inne sposoby pomiaru stężenia białka

Absorbancja przy 280 nm jest jedną z kilku powszechnie stosowanych metod laboratoryjnych.

• Test Bradforda: wykorzystuje barwnik, który zmienia kolor po związaniu z białkiem. Dobrze sprawdza się w przypadku nieoczyszczonych próbek, ale zmiana barwy może różnić się w zależności od białka.
• Test BCA: opiera się na zmianie barwy wywołanej przez wiązania peptydowe białka. Jest zgodny z wieloma detergentami, ale jego wykonanie trwa dłużej niż bezpośredni pomiar absorbancji.
• Metoda Lowry’ego: starsza metoda o bardzo dużej czułości, która jednak słabo sprawdza się w obecności niektórych typowych składników buforów.

Każda z tych trzech metod niszczy próbkę. Bezpośredni pomiar A280 tego nie robi, więc tę samą próbkę można odzyskać i ponownie wykorzystać.

Często zadawane pytania

Jaki jest idealny zakres absorbancji dla tej metody?

Od 0,1 do 1,0. Poniżej 0,1 odczyt jest niedokładny. Powyżej 1,0 zależność między absorbancją a stężeniem może przestać być liniowa, dlatego próbkę należy najpierw rozcieńczyć.

Dlaczego wykonuje się pomiar przy 280 nm zamiast przy 260 nm?

Kwasy nukleinowe, takie jak DNA i RNA, silnie pochłaniają światło przy 260 nm. Białka absorbują więcej światła przy 280 nm ze względu na zawartość tryptofanu i tyrozyny. Pomiar przy 280 nm ogranicza zakłócenia powodowane przez kwasy nukleinowe obecne w próbce.

Jak wyznacza się współczynnik ekstynkcji białka, którego nie ma na liście?

W przypadku białka o znanej sekwencji narzędzie takie jak ProtParam oblicza go na podstawie liczby reszt tryptofanu, tyrozyny i cystyny. Można go również zmierzyć bezpośrednio, porównując absorbancję próbki z absorbancją roztworu o znanym stężeniu.

Czy ta metoda działa w przypadku mieszaniny białek?

Najlepiej sprawdza się w przypadku pojedynczego, oczyszczonego białka o znanym współczynniku ekstynkcji. Mieszaninę białek o nieznanym składzie, taką jak lizat komórkowy, zwykle oznacza się za pomocą testu Bradforda lub BCA, ponieważ metody te dają bardziej spójne oszacowanie całkowitej ilości białka.

Czy detergenty mogą zakłócać odczyt?

Tak. Wiele detergentów pochłania światło w pobliżu 280 nm, co może zniekształcać wynik. Użycie próby ślepej zawierającej takie samo stężenie detergentu pomaga skompensować tę absorbancję tła. Bardzo wysokie stężenia detergentów mogą wymagać zastosowania testu zgodnego z detergentami, takiego jak BCA.