Oblicz stężenie DNA na podstawie odczytów absorbancji (A260) z regulowanymi współczynnikami rozcieńczenia. Niezbędne narzędzie dla laboratoriów biologii molekularnej i badań genetycznych.
Stężenie DNA oblicza się za pomocą następującego wzoru:
Kalkulator stężenia DNA to niezbędne narzędzie online, które pomaga biologom molekularnym, genetykom i technikom laboratoryjnym dokładnie określić stężenie DNA na podstawie odczytów spektrofotometrycznych. Ten darmowy kalkulator wykorzystuje standardową metodę A260 do konwersji pomiarów absorpcji UV na precyzyjne wartości stężenia DNA w ng/μL.
Pomiar stężenia DNA jest podstawową procedurą w laboratoriach biologii molekularnej, stanowiącą kluczowy krok kontroli jakości przed PCR, sekwencjonowaniem, klonowaniem i innymi technikami molekularnymi. Nasz kalkulator eliminuje ręczne obliczenia i redukuje błędy przy określaniu zarówno stężenia, jak i całkowitych ilości DNA w próbkach.
Obliczanie stężenia DNA opiera się na prawie Beer-Lamberta, które stwierdza, że absorpcja roztworu jest proporcjonalna do stężenia absorbującego gatunku w roztworze oraz długości drogi światła przez roztwór. Dla DNA podwójnie spiralnego, absorpcja wynosząca 1.0 przy 260nm (A260) w kuwetce o długości drogi 1cm odpowiada stężeniu wynoszącemu około 50 ng/μL.
Stężenie DNA oblicza się za pomocą następującego wzoru:
Gdzie:
Całkowitą ilość DNA w próbce można następnie obliczyć za pomocą:
Absorpcja przy 260nm (A260):
Współczynnik Konwersji (50):
Współczynnik Rozcieńczenia:
Objętość:
Postępuj zgodnie z tym prostym procesem, aby obliczyć stężenie DNA na podstawie swoich odczytów A260:
Pomiar stężenia DNA jest niezbędny w wielu zastosowaniach biologii molekularnej i badań:
Przed ligowaniem fragmentów DNA do wektorów, znajomość dokładnego stężenia pozwala badaczom obliczyć optymalny stosunek wstawki do wektora, maksymalizując efektywność transformacji. Na przykład, molarny stosunek 3:1 wstawki do wektora często daje najlepsze wyniki, co wymaga precyzyjnych pomiarów stężenia obu składników.
Reakcje PCR zazwyczaj wymagają 1-10 ng DNA szablonowego dla optymalnej amplifikacji. Zbyt mało DNA może prowadzić do niepowodzenia amplifikacji, podczas gdy zbyt dużo może hamować reakcję. Dla ilościowego PCR (qPCR) konieczne jest jeszcze dokładniejsze określenie ilości DNA, aby zapewnić dokładne krzywe standardowe i wiarygodne ilościowanie.
Protokóły przygotowania bibliotek NGS określają dokładne ilości DNA wejściowego, często w zakresie 1-500 ng w zależności od platformy i zastosowania. Dokładny pomiar stężenia jest niezbędny do udanego przygotowania bibliotek i zrównoważonej reprezentacji próbek w wielokrotnych sekwencjach.
Podczas wprowadzania DNA do komórek eukariotycznych, optymalna ilość DNA różni się w zależności od typu komórki i metody transfekcji. Zazwyczaj używa się 0.5-5 μg DNA plazmidowego na studzienkę w formacie 6-studzienkowym, co wymaga precyzyjnego pomiaru stężenia w celu standaryzacji eksperymentów.
W zastosowaniach kryminalistycznych próbki DNA są często ograniczone i cenne. Dokładna kwantyfikacja pozwala naukowcom kryminalistycznym określić, czy wystarczająca ilość DNA jest obecna do profilowania oraz standaryzować ilość DNA używaną w kolejnych analizach.
Enzymy restrykcyjne mają określone jednostki aktywności zdefiniowane na μg DNA. Znajomość dokładnego stężenia DNA pozwala na odpowiednie proporcje enzymu do DNA, zapewniając całkowite trawienie bez aktywności "star" (cięcia niespecyficznego).
Chociaż spektrofotometria UV jest najczęściej stosowaną metodą kwantyfikacji DNA, istnieje kilka alternatyw:
Metody Fluorometryczne:
Elektroforeza w Żelu Agarozowym:
Real-Time PCR:
Cyfrowa PCR:
Możliwość dokładnego pomiaru stężenia DNA znacznie ewoluowała wraz z postępem biologii molekularnej:
Po odkryciu struktury DNA przez Watsona i Cricka w 1953 roku, naukowcy zaczęli opracowywać metody izolacji i kwantyfikacji DNA. Wczesne podejścia opierały się na testach kolorometrycznych, takich jak reakcja difenylaminowa, która wytwarzała niebieski kolor w reakcji z deoksyrybozą w DNA. Metody te były stosunkowo mało wrażliwe i podatne na zakłócenia.
Zastosowanie spektrofotometrii UV do kwantyfikacji kwasów nukleinowych stało się powszechne w latach 70. Naukowcy odkryli, że DNA absorbuje światło UV z maksimum przy 260nm, a związek między absorpcją a stężeniem był liniowy w pewnym zakresie. Współczynnik konwersji 50 ng/μL dla DNA podwójnie spiralnego przy A260 = 1.0 został ustalony w tym okresie.
Opracowanie specyficznych dla DNA barwników fluorescencyjnych w latach 80. i 90. zrewolucjonizowało kwantyfikację DNA, szczególnie dla rozcieńczonych próbek. Barwniki Hoechst i później PicoGreen umożliwiły znacznie bardziej wrażliwe wykrywanie niż było to możliwe przy użyciu spektrofotometrii. Metody te stały się szczególnie ważne wraz z pojawieniem się PCR, które często wymagało precyzyjnej kwantyfikacji minimalnych ilości DNA.
Wprowadzenie spektrofotometrów mikroobjętości, takich jak NanoDrop, na początku lat 2000 zrewolucjonizowało rutynową kwantyfikację DNA, wymagając jedynie 0.5-2 μL próbki. Ta technologia wyeliminowała potrzebę rozcieńczeń i kuwet, przyspieszając i ułatwiając proces.
Dziś zaawansowane techniki, takie jak cyfrowa PCR i sekwencjonowanie nowej generacji, przesunęły granice kwantyfikacji DNA jeszcze dalej, umożliwiając absolutną kwantyfikację specyficznych sekwencji i detekcję pojedynczych cząsteczek. Jednak podstawowa zasada spektrofotometryczna ustalona dziesięciolecia temu pozostaje fundamentem rutynowego pomiaru stężenia DNA w laboratoriach na całym świecie.
Przejdźmy przez kilka praktycznych przykładów obliczeń stężenia DNA:
Badacz oczyścił plazmid i uzyskał następujące pomiary:
Obliczenie:
Po ekstrakcji DNA genomowego z krwi:
Obliczenie:
Protokół sekwencjonowania wymaga dokładnie 500 ng DNA:
Objętość potrzebna = 500 ÷ 125 = 4 μL roztworu DNA
Oto przykłady, jak obliczyć stężenie DNA w różnych językach programowania:
1' Formuła Excel do obliczania stężenia DNA
2=A260*50*WspółczynnikRozcieńczenia
3
4' Formuła Excel do obliczania całkowitej ilości DNA w μg
5=(A260*50*WspółczynnikRozcieńczenia*Objętość)/1000
6
7' Przykład w komórce z A260=0.5, WspółczynnikRozcieńczenia=2, Objętość=100
8=0.5*50*2*100/1000
9' Wynik: 5 μg
10def calculate_dna_concentration(absorbance, dilution_factor=1): """ Oblicz stężenie DNA w ng/μL Parametry: absorbance (float): Odczyt absorpcji przy 260nm dilution_factor (float): Współczynnik rozcieńczenia próbki Zwraca: float: Stężenie DNA w ng/μL
Odkryj więcej narzędzi, które mogą być przydatne dla Twojego przepływu pracy