Kalkulator Stężenia DNA

Kalkulator stężenia DNA przelicza odczyt absorbancji UV przy 260 nanometrach, oznaczany jako A260, na stężenie DNA w nanogramach na mikrolitr (ng/µL). Podaje również całkowitą ilość DNA w próbce, w mikrogramach (µg).

Czym jest absorbancja A260?

A260 to ilość światła ultrafioletowego pochłanianego przez roztwór przy długości fali 260 nanometrów. DNA pochłania światło UV najsilniej w pobliżu tej długości fali ze względu na obecność zasad nukleotydowych. Spektrofotometr mierzy A260 po wykonaniu pomiaru ślepej próby, w którym używa się tego samego buforu co w próbce, aby usunąć absorbancję tła. Im więcej DNA znajduje się w roztworze, tym wyższy jest odczyt A260.

Wzór na stężenie DNA

Dwuniciowe DNA pochłania światło UV proporcjonalnie do swojego stężenia; zależność ta jest znana jako prawo Beera-Lamberta. Przy standardowej drodze optycznej o długości 1 centymetra roztwór o odczycie A260 wynoszącym 1,0 zawiera około 50 ng/µL dwuniciowego DNA. Ta wartość, czyli współczynnik przeliczeniowy, pozwala przeliczyć dowolny odczyt A260 na stężenie:

Stężenie DNA (ng/µL) = A260 × 50 × współczynnik rozcieńczenia

Współczynnik rozcieńczenia uwzględnia każde rozcieńczenie wykonane przed pomiarem próbki. Dla próbki zmierzonej bez rozcieńczania współczynnik rozcieńczenia wynosi 1.

Jak obliczyć całkowitą wydajność DNA

Po ustaleniu stężenia całkowitą masę DNA w próbce można obliczyć na podstawie jej objętości:

Całkowita ilość DNA (µg) = stężenie (ng/µL) × objętość (µL) ÷ 1000

Jak obliczyć stężenie DNA: krok po kroku

Dokładnie wymieszaj próbkę przed pomiarem. DNA może przywierać do ścianek probówki lub nierównomiernie opadać.
Rozcieńcz próbkę, jeśli jest silnie stężona, dążąc do uzyskania odczytu A260 między 0,1 a 1,0. Poza tym zakresem odczyty spektrofotometru są najmniej wiarygodne.
Wykonaj pomiar ślepej próby spektrofotometru z użyciem tego samego buforu, który zastosowano do rozcieńczenia, a następnie zmierz próbkę przy 260 nm.
Wprowadź do kalkulatora odczyt A260, objętość próbki i współczynnik rozcieńczenia, aby uzyskać stężenie i całkowitą wydajność. Wszystkie trzy pola muszą być wypełnione, a objętość musi być większa od zera, aby pojawił się wynik.

Przykład obliczeń

Przykład 1: próbka nierozcieńczona

Odczyt A260 wynosi 0,5, próbka nie została rozcieńczona (współczynnik rozcieńczenia 1), a jej objętość wynosi 100 µL.

Stężenie = 0,5 × 50 × 1 = 25 ng/µL
Całkowita ilość DNA = 25 × 100 ÷ 1000 = 2,5 µg

Przykład 2: próbka rozcieńczona

Probówka zawiera 50 µL oczyszczonego DNA. Niewielką jego część rozcieńczono 10-krotnie, a odczyt A260 rozcieńczonej części wyniósł 0,75. Współczynnik rozcieńczenia przelicza ten odczyt z powrotem na stężenie w pierwotnej probówce, a 50 µL to objętość wprowadzana w etapie obliczania całkowitej wydajności.

Stężenie = 0,75 × 50 × 10 = 375 ng/µL
Całkowita ilość DNA = 375 × 50 ÷ 1000 = 18,75 µg

Obliczanie współczynnika rozcieńczenia

Współczynnik rozcieńczenia = całkowita objętość po rozcieńczeniu ÷ objętość próbki pierwotnej.

Dodanie 5 µL roztworu DNA do 45 µL buforu daje całkowitą objętość 50 µL, więc współczynnik rozcieńczenia wynosi 50 ÷ 5 = 10. Dla próbki, której nie rozcieńczono, współczynnik rozcieńczenia wynosi 1.

Typowe zakresy stężeń DNA

Stężenie zależy od rodzaju próbki i metody ekstrakcji. Stężenia uzyskiwane podczas ekstrakcji genomowego DNA zwykle mieszczą się w przybliżeniu między 10 a 100 ng/µL. Preparaty plazmidowego DNA często mają wyższe stężenia, czasami sięgające kilkuset ng/µL. Wynik znacznie odbiegający od zakresu oczekiwanego dla danej metody może wskazywać na problem z ekstrakcją lub samym pomiarem.

Ograniczenia pomiaru absorbancji UV

Pomiar A260 jest szybki, ale nie jest najbardziej czułą ani swoistą metodą oznaczania DNA. Białka, RNA i niektóre składniki buforu również pochłaniają światło w pobliżu 260 nm i mogą zawyżać odczyt. Do oceny zanieczyszczenia białkiem często sprawdza się stosunek A260/A280 wraz ze stężeniem; stosunek bliski 1,8 zwykle wskazuje na czystą próbkę DNA. Metody oparte na barwnikach fluorescencyjnych, takie jak testy Qubit, wiążą się wyłącznie z dwuniciowym DNA i dają dokładniejszy odczyt w przypadku próbek rozcieńczonych lub zanieczyszczonych, choć wymagają dodatkowych odczynników i fluorometru.

Najczęściej zadawane pytania

Jak obliczyć stężenie DNA na podstawie A260?

Pomnóż odczyt A260 przez 50, czyli standardowy współczynnik przeliczeniowy dla dwuniciowego DNA, a następnie pomnóż wynik przez współczynnik rozcieńczenia. Jeśli próbka nie była rozcieńczana, użyj współczynnika rozcieńczenia 1.

Jaki stosunek A260/A280 jest prawidłowy?

Stosunek bliski 1,8 zwykle wskazuje na czystą próbkę DNA. Niższy stosunek sugeruje zanieczyszczenie białkiem. Stosunek powyżej 2,0 może wskazywać na zanieczyszczenie RNA.

Czy tego kalkulatora można używać do RNA?

Nie bezpośrednio, ponieważ dla RNA stosuje się współczynnik przeliczeniowy 40 ng/µL zamiast 50. Aby oszacować stężenie RNA, pomnóż wynik kalkulatora przez 0,8 (40 ÷ 50) albo bezpośrednio użyj wzoru A260 × 40 × współczynnik rozcieńczenia.

Dlaczego odczyt A260 powinien mieścić się między 0,1 a 1,0?

Absorbancja pozostaje w przybliżeniu proporcjonalna do stężenia, zgodnie z prawem Beera-Lamberta, głównie w tym zakresie. Poza nim odczyty stają się mniej wiarygodne, dlatego próbkę o zbyt wysokim lub zbyt niskim stężeniu należy przed ponownym pomiarem rozcieńczyć albo zatężyć.

Jaka jest różnica między stężeniem a czystością?

Stężenie określa ilość DNA obecną w próbce, w ng/µL. Czystość określa, jak wolna od zanieczyszczeń jest próbka, przede wszystkim na podstawie stosunków absorbancji, takich jak A260/A280. Próbka może mieć wysokie stężenie i jednocześnie być zanieczyszczona albo mieć niskie stężenie i być bardzo czysta.

Jak przeliczyć ng/µL na µg/mL?

Obie jednostki są liczbowo równoważne. 1 ng/µL równa się 1 µg/mL, ponieważ zarówno jednostka masy, jak i jednostka objętości zmieniają skalę o współczynnik 1000.

Piśmiennictwo

Sambrook, J. i Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3. wyd.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Gallagher, S. R. i Desjardins, P. R. (2006). Quantitation of DNA and RNA with absorption and fluorescence spectroscopy. Current Protocols in Molecular Biology, 76(1), A-3D.
Manchester, K. L. (1995). Value of A260/A280 ratios for measurement of purity of nucleic acids. BioTechniques, 19(2), 208–210.

Kalkulator Stężenia DNA | Przelicznik A260 na ng/μL