Calculadora de Eficiência de qPCR: Ferramenta de Análise de Curva Padrão

Calculadora de eficiência de qPCR

Uma calculadora de eficiência de qPCR estima quão bem uma reação de PCR quantitativa (qPCR) copia sua sequência de DNA-alvo a cada ciclo de amplificação. Ela usa valores de Ct (o número do ciclo em que o sinal fluorescente ultrapassa um limite definido) de uma série de diluições para calcular a eficiência, a inclinação, o intercepto e o R².

O que é eficiência de qPCR?

A PCR quantitativa acompanha a fluorescência à medida que uma reação copia uma sequência de DNA-alvo, ciclo a ciclo. A eficiência de amplificação descreve quanto aumenta a quantidade de DNA-alvo a cada ciclo. Com eficiência de 100%, a quantidade de DNA-alvo dobra a cada ciclo.

As reações reais raramente atingem exatamente 100%. A maioria dos laboratórios considera aceitável, para uma quantificação confiável, uma eficiência entre 90% e 110%. Um valor abaixo de 90% ou acima de 110% indica um problema, como desenho inadequado dos primers, inibidores de PCR carregados da extração da amostra ou erros de pipetagem na série de diluições.

A eficiência é mais importante ao comparar a expressão gênica entre amostras. O método comum ΔΔCt para calcular a variação de expressão pressupõe que todas as reações ocorram com eficiência de 100%. Quando a eficiência medida difere de 100%, ou quando um gene-alvo e um gene de referência têm eficiências diferentes, os resultados da variação de expressão podem ser imprecisos.

Fórmula da eficiência de qPCR

A eficiência é calculada a partir da inclinação da curva-padrão, uma linha formada pela representação dos valores de Ct em relação ao logaritmo na base 10 (log10) da quantidade de DNA inicial em uma série de diluições.

E = 10^(-1/inclinação) - 1

E é a eficiência, expressa como decimal (multiplique por 100 para obter a porcentagem). A inclinação é a inclinação da linha da curva-padrão. Ela é negativa, porque o Ct aumenta à medida que diminui a quantidade de DNA inicial.

Uma inclinação de -3,32 corresponde a uma eficiência de 100%:

10^(-1/-3,32) - 1 = 10^0,301–1 ≈ 1,00

Isso ocorre porque uma diluição de 10 vezes deve deslocar o Ct em cerca de 3,32 ciclos se a reação dobrar seu DNA a cada ciclo, pois log2(10) é aproximadamente 3,32.

Na prática, uma inclinação entre -3,1 e -3,6 é considerada aceitável. Esse intervalo corresponde a uma eficiência de aproximadamente 90% a 110%. Uma inclinação mais próxima de -3,1 produz uma eficiência calculada mais alta; uma inclinação mais próxima de -3,6 produz uma eficiência mais baixa.

Como calcular a eficiência de qPCR: o método da curva-padrão

Prepare uma série de diluições. Comece com a amostra mais concentrada e dilua-a por um fator fixo, geralmente 10 vezes, para cada amostra seguinte. Faça qPCR em cada diluição e registre seu valor de Ct.
Converta cada diluição em um valor de log10. Considerando a primeira amostra, a mais concentrada, como a posição 0, a amostra de número i tem log10 (quantidade relativa) igual a -i × log10 (fator de diluição).
Represente o Ct (eixo vertical) em relação ao valor de log10 (eixo horizontal) para cada diluição e faça uma regressão linear.
Obtenha a inclinação, o intercepto e o R² da linha de regressão.
Insira a inclinação em E = 10^(-1/inclinação) - 1 para obter a eficiência.

Critérios de qualidade da curva-padrão

R² de pelo menos 0,98. Isso mede quão próximos os pontos estão de uma linha reta. Um valor mais baixo geralmente indica erros de pipetagem ou amplificação inconsistente.
Inclinação entre -3,1 e -3,6. Esse intervalo corresponde a uma eficiência de 90–110%.
Pelo menos três pontos de diluição. Cinco ou seis pontos produzem uma linha mais confiável e facilitam a identificação de um valor discrepante.
A amostra mais concentrada deve produzir um Ct em torno de 15-20. A amostra mais diluída deve permanecer abaixo de Ct 35, pois valores acima disso se aproximam do limite de detecção.

Exemplo prático

Uma série de diluições de cinco pontos, com diluição de 10 vezes, produz estes valores de Ct, da mais concentrada à menos concentrada: 15,0, 18,5, 22,0, 25,5, 29,0.

Os valores de log10 (quantidade relativa) são 0, -1, -2, -3, -4, pois cada etapa de diluição adiciona -log10(10), ou -1. O Ct aumenta 3,5 ciclos a cada etapa, portanto os pontos formam uma linha reta e a regressão linear fornece:

Inclinação: -3,5
Intercepto: 15,0
R²: 1,0

Eficiência: E = 10^(-1/-3,5) - 1 = 10^0,286–1 ≈ 0,931, ou cerca de 93%.

Uma eficiência de 93% com R² = 1,0 atende aos critérios de qualidade padrão e é adequada para a quantificação da expressão gênica.

Exemplo de código

Esta função JavaScript segue o mesmo método da calculadora. O índice de cada valor de Ct é negado antes da aplicação do logaritmo, porque a primeira amostra, a mais concentrada, tem a maior quantidade relativa, e cada amostra seguinte é mais diluída.

1function qpcrEfficiency(ctValues, dilutionFactor) {
2  // Sample 0 is most concentrated; each later sample is diluted further,
3  // so its log10(relative quantity) is negative.
4  const x = ctValues.map((_, i) => -i * Math.log10(dilutionFactor));
5  const n = ctValues.length;
6  let sumX = 0, sumY = 0, sumXY = 0, sumXX = 0;
7  for (let i = 0; i < n; i++) {
8    sumX += x[i];
9    sumY += ctValues[i];
10    sumXY += x[i] * ctValues[i];
11    sumXX += x[i] * x[i];
12  }
13  const slope = (n * sumXY - sumX * sumY) / (n * sumXX - sumX * sumX);
14  const intercept = (sumY - slope * sumX) / n;
15  const efficiency = (Math.pow(10, -1 / slope) - 1) * 100;
16  return { efficiency, slope, intercept };
17}
18
19qpcrEfficiency([15.0, 18.5, 22.0, 25.5, 29.0], 10);
20// => { efficiency: 93.07, slope: -3.5, intercept: 15 }
21

Por que a eficiência é importante para a expressão gênica

Os cálculos de variação de expressão, incluindo o método ΔΔCt, pressupõem que todas as reações dobrem seu alvo a cada ciclo. Quando um gene-alvo e um gene de referência têm eficiências determinadas experimentalmente diferentes, a fórmula simples de ΔΔCt introduz erro. Os pesquisadores frequentemente passam a usar um cálculo corrigido pela eficiência, como o método descrito por Michael Pfaffl em 2001, quando as eficiências diferem em mais de cerca de cinco pontos percentuais. As diretrizes MIQE, um conjunto amplamente citado de padrões de relato para qPCR publicado em 2009, recomendam que os estudos relatem a eficiência calculada, a inclinação e o R² juntamente com os resultados de quantificação.

Perguntas frequentes

Qual é uma boa porcentagem de eficiência de qPCR?

Geralmente, aceita-se um valor entre 90% e 110%, com ensaios bem otimizados situados em torno de 95–105%. Uma inclinação de -3,32 corresponde exatamente a 100%.

Por que minha eficiência de qPCR está acima de 110%?

As causas comuns incluem erros de pipetagem na série de diluições, dímeros de iniciadores, inibidores que afetam de maneira desigual as amostras concentradas e diluídas ou um limiar de fluorescência definido fora da fase exponencial da amplificação. Uma curva de fusão com mais de um pico pode indicar dímeros de iniciadores.

Por que minha eficiência de qPCR está abaixo de 90%?

As causas prováveis incluem desenho inadequado dos primers, inibidores de PCR carregados da extração da amostra ou uma temperatura de anelamento abaixo do ideal. Verificar a especificidade dos primers e executar um gradiente de temperatura pode ajudar a encontrar a causa.

O que significa um valor baixo de R²?

O R² mede quão bem os valores de Ct se ajustam a uma linha reta em relação à quantidade em logaritmo. Um valor abaixo de 0,98 sugere inconsistência de pipetagem, uma amostra inibida ou um ponto de diluição próximo ao limite de detecção.

De quantos pontos de diluição uma curva-padrão precisa?

Pelo menos três, o mínimo necessário para uma regressão linear. Cinco ou seis pontos fornecem uma inclinação mais confiável e facilitam a identificação de valores discrepantes.

A eficiência pode mudar entre experimentos?

Sim. Um novo lote de reagentes, um novo lote de primers, um tipo diferente de amostra ou um instrumento de qPCR diferente pode alterar a eficiência. Muitos laboratórios reavaliam a eficiência a cada poucos meses ou a cada novo lote de reagentes.

Referências

Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. As diretrizes MIQE: informações mínimas para publicação de experimentos de PCR quantitativa em tempo real. Clinical Chemistry. 2009;55(4):611-622.
Pfaffl MW. Um novo modelo matemático para quantificação relativa em RT-PCR em tempo real. Nucleic Acids Research. 2001;29(9):e45.
Svec D, Tichopad A, Novosadova V, Pfaffl MW, Kubista M. Quão boa é uma estimativa da eficiência de PCR: recomendações para avaliações precisas e confiáveis da eficiência de qPCR. Biomolecular Detection and Quantification. 2015;3:9-16.

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