Calculadora de Ligação de DNA - Calcule Proporções de Inserção:Vetor para Clonagem Molecular

A ligação de DNA é a etapa da clonagem molecular em que um fragmento de inserto é unido a um vetor plasmidial pela enzima T4 DNA ligase. Uma calculadora de ligação de DNA determina quantos microlitros de DNA do inserto e de DNA do vetor devem ser misturados para que a reação atinja uma razão molar escolhida entre inserto e vetor.

O que a calculadora faz

A calculadora recebe seis entradas: concentração do vetor, comprimento do vetor, concentração do inserto, comprimento do inserto, razão molar-alvo entre inserto e vetor e volume total da reação. Ela também permite definir quanto DNA do vetor usar, com valor padrão de 50 nanogramas (ng). Com esses valores, calcula o volume de vetor a ser pipetado, o volume de inserto a ser pipetado e quanto de tampão ou água adicionar para atingir o volume total da reação.

A concentração é medida em nanogramas por microlitro (ng/μL), geralmente determinada com um instrumento Nanodrop ou Qubit. O comprimento é medido em pares de bases (bp). Um quilobase (kb) equivale a 1000 pares de bases. A razão molar descreve quantas moléculas de inserto devem estar presentes para cada molécula de vetor. Ela não é uma razão de massa.

Por que se usa a razão molar, e não a massa

Massas iguais de DNA não contêm números iguais de moléculas. Um inserto curto pesa menos que um vetor longo com o mesmo número de moléculas. Misturar quantidades iguais em nanogramas de um inserto curto e de um vetor longo deixaria moléculas de inserto em quantidade muito baixa em relação às moléculas de vetor. A calculadora ajusta a massa do inserto pela razão entre os comprimentos dos fragmentos, para que a mistura final tenha o número pretendido de moléculas de inserto por molécula de vetor.

Fórmula da ligação de DNA

A quantidade necessária de DNA do inserto, em nanogramas, é:

$m_i = m_v \times \frac{k_i}{k_v} \times R$

em que $m_i$ é a quantidade de inserto em nanogramas, $m_v$ é a quantidade de vetor em nanogramas, $k_i$ é o comprimento do inserto em quilobases, $k_v$ é o comprimento do vetor em quilobases, e R é a razão molar alvo entre inserto e vetor.

Depois que essa quantidade é conhecida, a calculadora converte cada quantidade em um volume que pode ser pipetado:

$V_v = \frac{m_v}{c_v}$

$V_i = \frac{m_i}{c_i}$

$V_b = V_t - V_v - V_i$

em que $V_v$ e $V_i$ são os volumes do vetor e do inserto em microlitros, $c_v$ e $c_i$ são as concentrações do vetor e do inserto em nanogramas por microlitro, $V_b$ é o volume do tampão, e $V_t$ é o volume total da reação.

Se os volumes do vetor e do inserto juntos forem maiores que o volume total da reação, não sobrará espaço para tampão, ligase ou água. Nesse caso, a calculadora informa que o volume total é pequeno demais, em vez de mostrar uma quantidade negativa de tampão.

Exemplo prático

Um pesquisador está clonando um fragmento de gene de 1 kb em um vetor plasmidial de 3 kb. O plano é usar 50 ng de DNA do vetor em uma razão molar inserto:vetor de 3:1, em uma reação de 20 μL.

Entradas:

• Concentração do vetor: 50 ng/μL
• Comprimento do vetor: 3000 bp (3 kb)
• Concentração do inserto: 25 ng/μL
• Comprimento do inserto: 1000 bp (1 kb)
• Razão molar: 3
• Volume total: 20 μL
• Quantidade de vetor: 50 ng

Etapa 1: quantidade de inserto

ng de inserto = 50 × (1 ÷ 3) × 3 = 50 ng

Etapa 2: volumes

Volume de vetor = 50 ng ÷ 50 ng/μL = 1 μL

Volume de inserto = 50 ng ÷ 25 ng/μL = 2 μL

Volume de tampão = 20 − 1 − 2 = 17 μL

A reação contém 1 μL de vetor, 2 μL de inserto e 17 μL de tampão ou água, que também é o volume ao qual a ligase e seu tampão de reação são adicionados. Essa mistura fornece três moléculas de inserto para cada molécula de vetor.

Razões molares típicas para ligação

A maioria das clonagens padrão com extremidades coesivas, ou salientes, usa uma razão inserto:vetor de 3:1. Ligações que unem extremidades cegas são menos eficientes, por isso é comum usar uma razão maior, como 5:1. Inserções muito grandes às vezes funcionam melhor com uma razão menor, próxima de 1:1, pois fragmentos grandes já contribuem com muitos pares de bases por molécula.

Dúvidas frequentes

O que é a ligação de DNA?

A ligação de DNA é a união de dois fragmentos de DNA, geralmente um vetor plasmidial e um inserto, formando uma única molécula contínua. A enzima T4 DNA ligase sela a conexão entre as extremidades dos fragmentos.

O que significa a razão molar inserto:vetor?

É o número de moléculas de DNA do inserto presentes para cada molécula de vetor na reação. Uma razão 3:1 significa três moléculas de inserto para cada molécula de vetor, independentemente da comparação entre suas massas.

Por que não usar quantidades iguais, em nanogramas, de vetor e inserto?

Fragmentos de DNA com comprimentos diferentes têm massas diferentes por molécula. Um inserto de 1 kb pesa aproximadamente um terço do que pesa um vetor de 3 kb, molécula a molécula. Quantidades iguais em nanogramas de cada um não forneceriam números iguais de moléculas, por isso a calculadora ajusta a massa do inserto para corresponder à razão molar-alvo.

O que significa o volume total ser pequeno demais?

Isso significa que somente os volumes do vetor e do inserto já ocupam todo o volume da reação, sem deixar espaço para tampão ou ligase. A solução é aumentar o volume total da reação ou usar estoques de DNA mais concentrados.

Esta calculadora pode ser usada para clonagem por Gibson Assembly ou Golden Gate?

Não. Esses métodos usam uma química de reação diferente e geralmente têm como objetivo quantidades equimolares de todos os fragmentos, em vez de uma razão inserto:vetor fixa. Seus cálculos de volume diferem dos da clonagem padrão com T4 ligase.

Quanto DNA do vetor é normalmente usado?

50 ng é uma quantidade inicial comum para uma reação de ligação padrão. Os laboratórios também usam quantidades de 25 a 100 ng, ajustadas à concentração do DNA e à escala da reação.