Calculadora de Ligation de DNA

Introdução

A ligadura de DNA é uma técnica crítica da biologia molecular usada para unir fragmentos de DNA com ligações covalentes. A Calculadora de Ligation de DNA é uma ferramenta essencial para pesquisadores, ajudando a determinar as quantidades ideais de DNA vetor e inserto necessárias para reações de ligadura bem-sucedidas. Ao calcular as proporções molares corretas entre o vetor (plasmídeo) e os fragmentos de DNA inseridos, esta calculadora garante experiências de clonagem molecular eficientes, minimizando reagentes desperdiçados e reações falhadas.

As reações de ligadura são fundamentais para engenharia genética, biologia sintética e procedimentos de clonagem molecular. Elas permitem que os cientistas criem moléculas de DNA recombinante inserindo genes de interesse em vetores plasmidiais para subsequente transformação em organismos hospedeiros. O sucesso dessas reações depende fortemente do uso das quantidades apropriadas de componentes de DNA, que é precisamente o que esta calculadora ajuda a determinar.

Seja você construindo vetores de expressão, criando bibliotecas de genes ou realizando subclonagens de rotina, esta calculadora de ligadura de DNA ajudará você a otimizar suas condições experimentais e aumentar sua taxa de sucesso. Ao inserir alguns parâmetros-chave sobre suas amostras de DNA, você pode rapidamente obter os volumes exatos necessários para sua reação de ligadura específica.

Fórmula/Cálculo

A calculadora de ligadura de DNA utiliza uma fórmula fundamental da biologia molecular que leva em conta os diferentes tamanhos e concentrações dos fragmentos de DNA que estão sendo unidos. O cálculo principal determina quanto DNA inserido é necessário em relação ao DNA vetor com base em seus respectivos comprimentos e na proporção molar desejada.

Cálculo da Quantidade de Inserto

A quantidade de DNA inserido necessária (em nanogramas) é calculada usando a seguinte fórmula:

$\text{ng de inserto} = \text{ng de vetor} \times \frac{\text{tamanho do inserto (kb)}}{\text{tamanho do vetor (kb)}} \times \text{proporção molar}$

Onde:

• ng de vetor = quantidade de DNA vetor usada na reação (tipicamente 50-100 ng)
• tamanho do inserto (kb) = comprimento do fragmento de DNA inserido em kilobases (kb)
• tamanho do vetor (kb) = comprimento do DNA vetor em kilobases (kb)
• proporção molar = proporção desejada de moléculas de inserto para moléculas de vetor (tipicamente 3:1 a 5:1)

Cálculos de Volume

Uma vez que a quantidade necessária de DNA inserido é determinada, os volumes necessários para a reação são calculados:

$\text{Volume do vetor (μL)} = \frac{\text{ng de vetor}}{\text{concentração do vetor (ng/μL)}}$

$\text{Volume do inserto (μL)} = \frac{\text{ng de inserto}}{\text{concentração do inserto (ng/μL)}}$

$\text{Volume do buffer/água (μL)} = \text{Volume total da reação (μL)} - \text{Volume do vetor (μL)} - \text{Volume do inserto (μL)}$

Exemplo de Cálculo

Vamos trabalhar através de um exemplo prático:

• Concentração do vetor: 50 ng/μL
• Comprimento do vetor: 3000 bp (3 kb)
• Concentração do inserto: 25 ng/μL
• Comprimento do inserto: 1000 bp (1 kb)
• Proporção molar desejada (inserto:vetor): 3:1
• Volume total da reação: 20 μL
• Quantidade de vetor a usar: 50 ng

Passo 1: Calcular a quantidade necessária de inserto $\text{ng de inserto} = 50 \text{ ng} \times \frac{1 \text{ kb}}{3 \text{ kb}} \times 3 = 50 \times 0.33 \times 3 = 50 \text{ ng}$

Passo 2: Calcular os volumes $\text{Volume do vetor} = \frac{50 \text{ ng}}{50 \text{ ng/μL}} = 1 \text{ μL}$

$\text{Volume do inserto} = \frac{50 \text{ ng}}{25 \text{ ng/μL}} = 2 \text{ μL}$

$\text{Volume do buffer/água} = 20 \text{ μL} - 1 \text{ μL} - 2 \text{ μL} = 17 \text{ μL}$

Este cálculo garante que haja três moléculas de inserto para cada molécula de vetor na reação, otimizando as chances de ligadura bem-sucedida.

Guia Passo a Passo para Usar a Calculadora

Nossa Calculadora de Ligation de DNA foi projetada para ser intuitiva e direta. Siga estes passos para calcular os volumes ideais para sua reação de ligadura:

1. Insira as Informações do Vetor:

   • Insira a concentração do seu vetor em ng/μL
   • Insira o comprimento do vetor em pares de bases (bp)
   • Especifique a quantidade de DNA vetor que você deseja usar na reação (ng)

2. Insira as Informações do Inserto:

   • Insira a concentração do seu inserto em ng/μL
   • Insira o comprimento do inserto em pares de bases (bp)

3. Defina os Parâmetros da Reação:

   • Especifique a proporção molar desejada (inserto:vetor) - tipicamente entre 3:1 e 5:1
   • Insira o volume total da reação em μL (geralmente 10-20 μL)

4. Visualize os Resultados:

   • A calculadora exibirá automaticamente:
     • Volume do vetor necessário (μL)
     • Volume do inserto necessário (μL)
     • Volume de buffer/água a ser adicionado (μL)
     • Volume total da reação (μL)
     • Quantidade de DNA vetor e inserto na reação (ng)

5. Copiar Resultados (opcional):

   • Use o botão "Copiar Resultados" para copiar todos os cálculos para sua área de transferência para seu caderno de laboratório ou protocolos

A calculadora realiza verificações de validação para garantir que todas as entradas sejam números positivos e que o volume total seja suficiente para os volumes de DNA necessários. Se algum erro for detectado, mensagens de erro úteis o guiarão para corrigir as entradas.

Casos de Uso

A Calculadora de Ligation de DNA é valiosa em diversas aplicações de biologia molecular:

Clonagem Molecular

O caso de uso mais comum é a clonagem molecular padrão, onde os pesquisadores inserem genes ou fragmentos de DNA em vetores plasmidiais. A calculadora garante condições ideais para:

• Subclonagem de genes entre diferentes vetores de expressão
• Criação de proteínas de fusão unindo múltiplos fragmentos de genes
• Construção de ensaios de genes reportadores
• Montagem de bibliotecas de plasmídeos

Biologia Sintética

Na biologia sintética, onde múltiplos fragmentos de DNA são frequentemente montados:

• Reações de Gibson Assembly se beneficiam de proporções precisas de inserto:vetor
• Sistemas de montagem Golden Gate requerem concentrações específicas de DNA
• Montagem de partes genéticas padronizadas BioBrick
• Construção de circuitos genéticos sintéticos

Desenvolvimento de Kits Diagnósticos

Ao desenvolver ferramentas de diagnóstico molecular:

• Clonagem de marcadores genéticos específicos de doenças
• Construção de plasmídeos de controle positivo
• Desenvolvimento de padrões de calibração para qPCR

Sistemas de Expressão de Proteínas

Para pesquisadores que trabalham na produção de proteínas:

• Otimização de proporções inserto:vetor para vetores de expressão de alta cópia
• Construção de sistemas de expressão induzíveis
• Criação de vetores de secreção para purificação de proteínas

Aplicações CRISPR-Cas9

Em aplicações de edição do genoma:

• Clonagem de RNAs guias em vetores CRISPR
• Criação de modelos doadores para reparo dirigido por homologia
• Montagem de bibliotecas de RNAs guias para triagem

Ligaduras Desafiadoras

A calculadora é particularmente valiosa para cenários de ligadura desafiadores:

• Clonagem de grandes inserções (>5 kb)
• Inserções de fragmentos muito pequenos (<100 bp)
• Ligaduras de extremidades cegas que têm menor eficiência
• Reações de montagem de múltiplos fragmentos

Alternativas

Embora nossa Calculadora de Ligation de DNA forneça cálculos precisos para reações de ligadura tradicionais, várias abordagens alternativas existem para unir fragmentos de DNA:

1. Gibson Assembly: Usa exonuclease, polimerase e ligase em uma reação de tubo único para unir fragmentos de DNA sobrepostos. Nenhum cálculo de ligadura tradicional é necessário, mas as proporções de concentração ainda são importantes.

2. Golden Gate Assembly: Usa enzimas de restrição do tipo IIS para montagem direcional e sem cicatriz de múltiplos fragmentos. Requer quantidades equimolares de todos os fragmentos.

3. SLIC (Clonagem Independente de Ligadura de Sequência): Usa exonuclease para criar extremidades de fita única que se anexam. Normalmente usa proporções equimolares de fragmentos.

4. In-Fusion Cloning: Sistema comercial que permite a junção de fragmentos com sobreposições de 15 bp. Usa uma proporção específica com base nos tamanhos dos fragmentos.

5. Gateway Cloning: Usa recombinação site-específica em vez de ligadura. Requer vetores de entrada e destino específicos.

6. Teste Empírico: Alguns laboratórios preferem configurar múltiplas reações de ligadura com diferentes proporções inserto:vetor (1:1, 3:1, 5:1, 10:1) e determinar qual funciona melhor para seus constructos específicos.

7. Calculadoras de Software: Pacotes de software comerciais como Vector NTI e SnapGene incluem calculadoras de ligadura com recursos adicionais, como análise de sítios de restrição.

História

O desenvolvimento de cálculos de ligadura de DNA paralela à evolução das técnicas de clonagem molecular, que revolucionaram a biologia molecular e a biotecnologia.

Primeiros Desenvolvimentos (1970)

O conceito de ligadura de DNA para clonagem molecular surgiu no início dos anos 1970 com o trabalho pioneiro de Paul Berg, Herbert Boyer e Stanley Cohen, que desenvolveram as primeiras moléculas de DNA recombinante. Durante esse período, as reações de ligadura eram em grande parte empíricas, com os pesquisadores usando tentativa e erro para determinar as condições ideais.

A descoberta de enzimas de restrição e DNA ligase forneceu as ferramentas essenciais para cortar e reunir moléculas de DNA. A T4 DNA ligase, isolada de E. coli infectada pelo bacteriófago T4, tornou-se a enzima padrão para unir fragmentos de DNA devido à sua capacidade de ligar tanto extremidades cegas quanto coesas.

Período de Refinamento (1980-1990)

À medida que a clonagem molecular se tornava mais rotineira, os pesquisadores começaram a desenvolver abordagens mais sistemáticas para reações de ligadura. A importância das proporções molares entre o DNA vetor e o inserto tornou-se aparente, levando ao desenvolvimento da fórmula básica ainda usada hoje.

Durante esse período, os pesquisadores estabeleceram que o excesso de DNA inserido (tipicamente 3:1 a 5:1 de proporção molar de inserto para vetor) geralmente melhorava a eficiência da ligadura para aplicações de clonagem padrão. Esse conhecimento foi inicialmente compartilhado através de protocolos de laboratório e gradualmente chegou a manuais e livros didáticos de biologia molecular.

Era Moderna (2000-Presente)

O advento de ferramentas computacionais e calculadoras online nos anos 2000 tornou os cálculos de ligadura precisos mais acessíveis aos pesquisadores. À medida que as técnicas de biologia molecular se tornaram mais sofisticadas, a necessidade de cálculos precisos se tornou mais crítica, especialmente para projetos de clonagem desafiadores que envolvem múltiplos fragmentos ou grandes inserções.

Hoje, os cálculos de ligadura de DNA são uma parte integral dos fluxos de trabalho de clonagem molecular, com calculadoras dedicadas como esta ajudando os pesquisadores a otimizar seus experimentos. A fórmula básica permaneceu em grande parte inalterada, embora nossa compreensão dos fatores que afetam a eficiência da ligadura tenha melhorado.

O surgimento de métodos alternativos de clonagem, como Gibson Assembly e clonagem Golden Gate, introduziu novas necessidades de cálculo, mas o conceito fundamental de proporções molares entre fragmentos de DNA permanece importante em todas essas técnicas.

Exemplos de Código

Aqui estão implementações da calculadora de ligadura de DNA em várias linguagens de programação:

1' Função VBA do Excel para Calculadora de Ligation de DNA
2Function CalculateInsertAmount(vectorAmount As Double, vectorLength As Double, insertLength As Double, molarRatio As Double) As Double
3    ' Calcular a quantidade necessária de inserto em ng
4    CalculateInsertAmount = vectorAmount * (insertLength / vectorLength) * molarRatio
5End Function
6
7Function CalculateVectorVolume(vectorAmount As Double, vectorConcentration As Double) As Double
8    ' Calcular o volume do vetor em μL
9    CalculateVectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration
10End Function
11
12Function CalculateInsertVolume(insertAmount As Double, insertConcentration As Double) As Double
13    ' Calcular o volume do inserto em μL
14    CalculateInsertVolume = insertAmount / insertConcentration
15End Function
16
17Function CalculateBufferVolume(totalVolume As Double, vectorVolume As Double, insertVolume As Double) As Double
18    ' Calcular o volume do buffer/água em μL
19    CalculateBufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume
20End Function
21
22' Exemplo de uso em uma célula:
23' =CalculateInsertAmount(50, 3000, 1000, 3)
24

1def calculate_ligation_volumes(vector_concentration, vector_length, insert_concentration, 
2                              insert_length, molar_ratio, total_volume, vector_amount=50):
3    """
4    Calcular volumes para uma reação de ligadura de DNA.
5    
6    Parâmetros:
7    vector_concentration (float): Concentração do DNA vetor em ng/μL
8    vector_length (float): Comprimento do DNA vetor em pares de bases
9    insert_concentration (float): Concentração do DNA inserido em ng/μL
10    insert_length (float): Comprimento do DNA inserido em pares de bases
11    molar_ratio (float): Proporção molar desejada de inserto:vetor
12    total_volume (float): Volume total da reação em μL
13    vector_amount (float): Quantidade de DNA vetor a usar em ng (padrão: 50)
14    
15    Retorna:
16    dict: Dicionário contendo volumes e quantidades calculadas
17    """
18    # Calcular volume do vetor
19    vector_volume = vector_amount / vector_concentration
20    
21    # Calcular a quantidade necessária de inserto
22    vector_length_kb = vector_length / 1000
23    insert_length_kb = insert_length / 1000
24    insert_amount = (vector_amount * insert_length_kb / vector_length_kb) * molar_ratio
25    
26    # Calcular volume do inserto
27    insert_volume = insert_amount / insert_concentration
28    
29    # Calcular volume do buffer/água
30    buffer_volume = total_volume - vector_volume - insert_volume
31    
32    return {
33        "vector_volume": round(vector_volume, 2),
34        "insert_volume": round(insert_volume, 2),
35        "buffer_volume": round(buffer_volume, 2),
36        "insert_amount": round(insert_amount, 2),
37        "vector_amount": vector_amount
38    }
39
40# Exemplo de uso
41result = calculate_ligation_volumes(
42    vector_concentration=50,
43    vector_length=3000,
44    insert_concentration=25,
45    insert_length=1000,
46    molar_ratio=3,
47    total_volume=20
48)
49
50print(f"Vetor: {result['vector_volume']} μL ({result['vector_amount']} ng)")
51print(f"Inserto: {result['insert_volume']} μL ({result['insert_amount']} ng)")
52print(f"Buffer: {result['buffer_volume']} μL")
53print(f"Total: 20 μL")
54

1function calculateLigationVolumes(vectorConcentration, vectorLength, insertConcentration, 
2                                insertLength, molarRatio, totalVolume, vectorAmount = 50) {
3  // Converter comprimentos para kb para cálculo
4  const vectorLengthKb = vectorLength / 1000;
5  const insertLengthKb = insertLength / 1000;
6  
7  // Calcular a quantidade necessária de inserto
8  const insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
9  
10  // Calcular volumes
11  const vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
12  const insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
13  const bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
14  
15  return {
16    vectorVolume: parseFloat(vectorVolume.toFixed(2)),
17    insertVolume: parseFloat(insertVolume.toFixed(2)),
18    bufferVolume: parseFloat(bufferVolume.toFixed(2)),
19    insertAmount: parseFloat(insertAmount.toFixed(2)),
20    vectorAmount: vectorAmount
21  };
22}
23
24// Exemplo de uso
25const result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
26console.log(`Vetor: ${result.vectorVolume} μL (${result.vectorAmount} ng)`);
27console.log(`Inserto: ${result.insertVolume} μL (${result.insertAmount} ng)`);
28console.log(`Buffer: ${result.bufferVolume} μL`);
29console.log(`Total: 20 μL`);
30

1public class DNALigationCalculator {
2    public static class LigationResult {
3        public final double vectorVolume;
4        public final double insertVolume;
5        public final double bufferVolume;
6        public final double insertAmount;
7        public final double vectorAmount;
8        
9        public LigationResult(double vectorVolume, double insertVolume, double bufferVolume, 
10                             double insertAmount, double vectorAmount) {
11            this.vectorVolume = vectorVolume;
12            this.insertVolume = insertVolume;
13            this.bufferVolume = bufferVolume;
14            this.insertAmount = insertAmount;
15            this.vectorAmount = vectorAmount;
16        }
17    }
18    
19    public static LigationResult calculateLigationVolumes(
20            double vectorConcentration, double vectorLength, 
21            double insertConcentration, double insertLength,
22            double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount) {
23        
24        // Converter comprimentos para kb
25        double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
26        double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
27        
28        // Calcular a quantidade necessária de inserto
29        double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
30        
31        // Calcular volumes
32        double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
33        double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
34        double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
35        
36        // Arredondar para 2 casas decimais
37        vectorVolume = Math.round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
38        insertVolume = Math.round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
39        bufferVolume = Math.round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
40        insertAmount = Math.round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
41        
42        return new LigationResult(vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount);
43    }
44    
45    public static void main(String[] args) {
46        LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20, 50);
47        
48        System.out.printf("Vetor: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.vectorVolume, result.vectorAmount);
49        System.out.printf("Inserto: %.2f μL (%.2f ng)%n", result.insertVolume, result.insertAmount);
50        System.out.printf("Buffer: %.2f μL%n", result.bufferVolume);
51        System.out.printf("Total: 20 μL%n");
52    }
53}
54

1#include <iostream>
2#include <cmath>
3#include <iomanip>
4
5struct LigationResult {
6    double vectorVolume;
7    double insertVolume;
8    double bufferVolume;
9    double insertAmount;
10    double vectorAmount;
11};
12
13LigationResult calculateLigationVolumes(
14    double vectorConcentration, double vectorLength,
15    double insertConcentration, double insertLength,
16    double molarRatio, double totalVolume, double vectorAmount = 50.0) {
17    
18    // Converter comprimentos para kb
19    double vectorLengthKb = vectorLength / 1000.0;
20    double insertLengthKb = insertLength / 1000.0;
21    
22    // Calcular a quantidade necessária de inserto
23    double insertAmount = (vectorAmount * insertLengthKb / vectorLengthKb) * molarRatio;
24    
25    // Calcular volumes
26    double vectorVolume = vectorAmount / vectorConcentration;
27    double insertVolume = insertAmount / insertConcentration;
28    double bufferVolume = totalVolume - vectorVolume - insertVolume;
29    
30    // Arredondar para 2 casas decimais
31    vectorVolume = std::round(vectorVolume * 100.0) / 100.0;
32    insertVolume = std::round(insertVolume * 100.0) / 100.0;
33    bufferVolume = std::round(bufferVolume * 100.0) / 100.0;
34    insertAmount = std::round(insertAmount * 100.0) / 100.0;
35    
36    return {vectorVolume, insertVolume, bufferVolume, insertAmount, vectorAmount};
37}
38
39int main() {
40    LigationResult result = calculateLigationVolumes(50, 3000, 25, 1000, 3, 20);
41    
42    std::cout << std::fixed << std::setprecision(2);
43    std::cout << "Vetor: " << result.vectorVolume << " μL (" << result.vectorAmount << " ng)" << std::endl;
44    std::cout << "Inserto: " << result.insertVolume << " μL (" << result.insertAmount << " ng)" << std::endl;
45    std::cout << "Buffer: " << result.bufferVolume << " μL" << std::endl;
46    std::cout << "Total: 20 μL" << std::endl;
47    
48    return 0;
49}
50

Perguntas Frequentes (FAQ)

Qual é a proporção molar ideal para a ligadura de DNA?

A proporção molar ideal de inserto para vetor geralmente varia de 3:1 a 5:1 para aplicações de clonagem padrão. No entanto, isso pode variar dependendo do cenário específico de ligadura:

• Para ligaduras de extremidades cegas: 3:1 a 5:1
• Para ligaduras de extremidades coesas: 1:1 a 3:1
• Para grandes inserções (>10 kb): 1:1 a 2:1
• Para pequenos inseridos (<500 bp): 5:1 a 10:1
• Para montagem de múltiplos fragmentos: 3:1 para cada inserto para vetor

Por que minha reação de ligadura está falhando, apesar de usar os volumes calculados?

Vários fatores podem afetar a eficiência da ligadura além da proporção molar:

1. Qualidade do DNA: Certifique-se de que tanto o vetor quanto o inserto tenham extremidades limpas e sem danos
2. De-fosforilação: Verifique se seu vetor foi de-fosforilado, o que impede a auto-ligação
3. Atividade da enzima: Verifique se sua ligase está ativa e usada na temperatura correta
4. Tempo de incubação: Algumas ligaduras se beneficiam de um tempo de incubação mais longo (durante a noite a 16°C)
5. Condições do buffer: Certifique-se de que o buffer correto com ATP está sendo usado
6. Contaminantes: Purifique o DNA para remover inibidores como EDTA ou sal alto

Quanto DNA vetor devo usar em uma reação de ligadura?

Tipicamente, 50-100 ng de DNA vetor são recomendados para reações de ligadura padrão. Usar muito vetor pode levar a um fundo mais alto de vetor não cortado ou auto-ligado, enquanto usar pouco pode reduzir a eficiência da transformação. Para ligaduras desafiadoras, você pode precisar otimizar essa quantidade.

Devo ajustar os cálculos para ligaduras de extremidades cegas em comparação com ligaduras de extremidades coesas?

Sim. Ligaduras de extremidades cegas são geralmente menos eficientes do que ligaduras de extremidades coesas. Para ligaduras de extremidades cegas, use:

• Proporções molares mais altas (3:1 a 5:1 ou até mais)
• Mais T4 DNA ligase (tipicamente 2-3 vezes mais)
• Tempos de incubação mais longos
• Considere adicionar PEG para aumentar a eficiência da ligadura

Como calculo a ligadura para múltiplos inseridos?

Para montagem de múltiplos fragmentos:

1. Calcule cada quantidade de inserto individualmente usando a mesma fórmula
2. Mantenha a mesma proporção molar total (por exemplo, para dois inseridos, use 1.5:1.5:1 inserto1:inserto2:vetor)
3. Ajuste o volume total da reação para acomodar todos os fragmentos de DNA
4. Considere ligação sequencial ou usar métodos de montagem como Gibson Assembly para múltiplos fragmentos

Posso usar esta calculadora para Gibson Assembly ou Golden Gate Assembly?

Esta calculadora é especificamente projetada para clonagem baseada em enzimas de restrição e ligase tradicionais. Para Gibson Assembly, quantidades equimolares de todos os fragmentos são tipicamente recomendadas (proporção 1:1), embora o cálculo básico da quantidade de DNA com base no comprimento seja semelhante. Para Golden Gate Assembly, proporções equimolares de todos os componentes também são normalmente usadas.

Como contabilizo a de-fosforilação do vetor em meus cálculos?

A de-fosforilação do vetor (remoção dos grupos fosfato 5') impede a auto-ligação, mas não altera os cálculos de quantidade. No entanto, para vetores de-fosforilados:

1. Use DNA inserido fresco com 5' fosfatos intactos
2. Considere usar proporções de inserto:veto ligeiramente mais altas (4:1 a 6:1)
3. Certifique-se de tempos de ligadura mais longos (pelo menos 1 hora à temperatura ambiente ou durante a noite a 16°C)

Qual é o volume mínimo total da reação que devo usar?

O volume total prático mínimo é tipicamente 10 μL, o que permite uma mistura adequada e previne problemas de evaporação. Se seus volumes de DNA calculados excederem o volume desejado da reação, você tem várias opções:

1. Use amostras de DNA mais concentradas
2. Reduza a quantidade de vetor usada (por exemplo, 25 ng em vez de 50 ng)
3. Aumente o volume total da reação
4. Considere concentrar suas amostras de DNA

Quanto tempo devo incubar minha reação de ligadura?

Os tempos de incubação ideais variam com base no tipo de ligadura:

• Ligaduras de extremidades coesas: 1 hora à temperatura ambiente (22-25°C) ou 4-16 horas a 16°C
• Ligaduras de extremidades cegas: 2-4 horas à temperatura ambiente ou durante a noite (12-16 horas) a 16°C
• Ligaduras rápidas (usando ligase de alta concentração): 5-15 minutos à temperatura ambiente

Posso reutilizar a reação de ligadura restante para transformação?

Sim, misturas de ligadura podem ser tipicamente armazenadas a -20°C e reutilizadas para transformação. No entanto, cada ciclo de congelamento-descongelamento pode reduzir a eficiência. Para melhores resultados:

1. Alíquotar a mistura de ligadura antes de congelar
2. Inativar o ligase (65°C por 10 minutos) antes do armazenamento
3. Usar dentro de 1-2 meses para resultados ideais

Referências

1. Sambrook J, Russell DW. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3ª ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

2. Green MR, Sambrook J. (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4ª ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.

3. Engler C, Kandzia R, Marillonnet S. (2008). A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS ONE, 3(11), e3647. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0003647

4. Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. (2009). Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods, 6(5), 343-345. https://doi.org/10.1038/nmeth.1318

5. Aslanidis C, de Jong PJ. (1990). Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research, 18(20), 6069-6074. https://doi.org/10.1093/nar/18.20.6069

6. Zimmerman SB, Pheiffer BH. (1983). Macromolecular crowding allows blunt-end ligation by DNA ligases from rat liver or Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences, 80(19), 5852-5856. https://doi.org/10.1073/pnas.80.19.5852

7. Addgene - Molecular Biology Reference. https://www.addgene.org/mol-bio-reference/

8. New England Biolabs (NEB) - DNA Ligation Protocol. https://www.neb.com/protocols/0001/01/01/dna-ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202

9. Thermo Fisher Scientific - Molecular Cloning Technical Reference. https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/cloning-learning-center.html

10. Promega - Cloning Technical Manual. https://www.promega.com/resources/product-guides-and-selectors/protocols-and-applications-guide/cloning/